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乳糖酶能分解乳及乳制品中的乳糖,生产低乳糖产品,解决“乳糖不耐症”。但常温乳糖酶在实际生产中存在着诸多不利因素,如杀菌温度低、活性低、生产成本高等。本论文以重组菌E.coli BL21/pET32-gal T242表达的来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans sp.T242的耐热乳糖酶为研究对象,对重组菌的发酵条件及诱导条件进行优化、研究重组酶的分离纯化及酶学特性。为耐热乳糖酶的工业化应用奠定基础。本文选用DNAStar、BLAST、SWISS-MODEL等软件或在线分析平台对耐热乳糖酶的基因序列进行分析比对及空间结构预测,发现实验室分离鉴定的Bacillus coagulans sp.T242耐热乳糖酶基因与GenBank数据库中Bacillus coagulans 36D1基因组DNA的部分序列完全相同,相似性达100%。推测该乳糖酶含665个氨基酸,预测其分子量为76.09kDa,共有两个糖基化位点:NKSW-181,NHTD-623。单因素实验优化重组E.coli的发酵产酶条件及诱导条件:种龄4h,接种量1.5%,装液量30%,摇床转速160r/min;发酵培养5h后加入诱导剂IPTG,终浓度为0.6mmol/L,诱导5h,诱导温度37℃。在此条件下得到的单位OD600酶活为5.242U/mmL。分别用DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-75分离纯化Bacillus coagulan 耐热乳糖酶,Ni-NTA亲和层析分离纯化重组E.coli耐热乳糖酶,纯化效率达75%,重组耐热乳糖酶酶活是出发菌的4.3倍。SDS-PAGE电泳检测纯化结果,估算重组耐热乳糖酶分子量约为55.0kDa。研究纯化后的重组耐热乳糖酶以ONPG为底物时的酶学特性,确定反应最适温度为50℃,55社℃以上温度稳定性差;反应最适pH为6.8,在中性偏酸条件下较稳定。酶反应中,离子浓度为1mmol/L时,Mg2+、Ca2+对酶活有明显的激活作用,其中Ca2+的作用尤其明显,达到空白对照的150%。Cu2+、Fe2+对酶活起到抑制作用,但影响不大。在pH 6.8,50℃条件下测得动力学常数 Km=2.21mmol/L,Vmax=0.87mmol/L·min。