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研究背景:周围神经损伤是临床常见病、多发病,也是疑难病。一旦周围神经损伤,其临床修复效果不尽人意,常常导致患者遗有运动或感觉功能障碍甚至残疾,给患者带来生活健康难题,同时也造成了巨大的社会压力与经济负担。周围神经与中枢神经系统不同的是,周围神经具有损伤后再生的能力。周围神经损伤后,远端发生华勒式变性,这种变性被认为是受损神经再生的关键步骤。近年来,有研究人员指出细胞自噬现象在华勒式变性过程中起着关键作用。细胞自噬现象广泛存在于多种细胞中,它通过降解细胞内蛋白质和受损细胞器来维持体内平衡。在自噬过程中,这些细胞器或蛋白质被包裹在双层膜结构中,并在溶酶体内降解。在神经系统中,自噬广泛发生在正常生理过程中,周围神经髓鞘的发育过程也需要自噬过程参与。而在病理条件下,自噬水平的降低可以导致多种神经退行性疾病;在神经创伤类损伤后,自噬溶酶体系统的抑制也会导致神经元坏死变性。在周围神经系统中,对自噬的研究也越来越广泛。施旺细胞在神经损伤修复过程中起着至关重要的作用,它不仅可以分泌多种神经营养因子,而又有证据表明它可以发生细胞自噬现象。外周神经损伤后,随着组织碎片的断裂,损伤神经远端髓鞘发生降解。髓鞘的降解不仅依赖于巨噬细胞的吞噬作用,而且施旺细胞的自噬在髓鞘降解过程中也起着至关重要的作用。白藜芦醇是从某些食品中提取的具有抗氧化性、减少炎症和减缓细胞衰老的天然产物。近年来,白藜芦醇对细胞自噬的促进作用越来越受到人们关注。白藜芦醇对神经系统具有保护作用,这种保护作用已经在脊髓损伤与脑缺血再灌注损伤动物模型中被证实。在周围神经系统中,白藜芦醇能够通过血管内皮生长因子信号通路加速神经修复再生过程,但白藜芦醇是否能够通过自噬机制促进周围神经再生有待进一步研究。研究目的:研究自噬现象在周围神经损伤修复中的作用及机制,探讨白藜芦醇促进周围神经损伤修复的机制;研究白藜芦醇对氧化应激刺激下的施旺细胞的保护作用,明确白藜芦醇在临床应用的可行性。研究方法:1.建立SD大鼠坐骨神经挤压伤模型。2.用步态分析的方法检测给药后运动神经功能恢复情况。3.对大鼠坐骨神经进行半薄切片,用电镜及甲苯胺蓝染色分析神经纤维再生数量与再生后髓鞘厚度,形态学评估药物作用下损伤的周围神经再生状况。4.用Western blot以及免疫荧光染色方法鉴定自噬相关蛋白与髓鞘蛋白的表达情况,用甲苯胺蓝染色形态学观察早期髓鞘降解过程,判断药物对损伤后周围神经早期华勒式变性过程的影响。5.用免疫组化方法判断自噬与白藜芦醇对周围神经损伤后施旺细胞增殖的影响。6.通过细胞与动物实验研究白藜芦醇的药物毒性。7.通过建立RSC96细胞氧化应激损伤模型,应用CCK-8方法检测白藜芦醇对细胞的保护作用。8.通过流式细胞仪检测细胞活性氧生成,探究白藜芦醇对活性氧生成的影响。9.通过Western blot与免疫荧光染色研究白藜芦醇对细胞保护作用及其机制。研究结果:1.自噬激动剂与白藜芦醇能够促进损伤后运动神经功能恢复;自噬抑制剂早期影响神经再生,但是在第二周,其恢复速度与对照组没有统计学差异。2.形态学证实在损伤后第14天,自噬激动剂与白藜芦醇均促进了神经再生数量,髓鞘厚度也有明显升高。3.与对照组相比,自噬激动剂与白藜芦醇均加速了早期髓鞘降解过程,MPZ水平降低,甲苯胺蓝染色提示髓鞘结构降解更完全。自噬抑制剂抑制了早期髓鞘降解过程,MPZ水平高于对照组;同时甲苯胺蓝染色提示完整髓鞘结构数量多于对照组。白藜芦醇促进了损伤早期施旺细胞自噬现象,免疫荧光染色结果表示LC3表达明显升高,western blot结果表示自噬相关蛋白LC3B-II/LC3B-I明显升高;电镜切片提示代表自噬的双层膜结构在施旺细胞中广泛存在,多于对照组。4.免疫组化表明自噬激动剂与白藜芦醇均能够明显促进施旺细胞Ki67的表达水平,说明自噬激动剂与白藜芦醇促进了损伤早期施旺细胞的增殖过程。5.25μM浓度的白藜芦醇作用下,RSC96细胞活性与对照组无显著差异;在最高200mg/kg的给药浓度下连续腹腔给药一周后,大鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏与肺组织HE染色均未出现明显损伤,说明白藜芦醇具毒性低,提示我们白藜芦醇可能被应用于未来临床研究。6.白藜芦醇增加了H2O2刺激下细胞的存活率,这种作用能够被自噬抑制剂阻断。7.白藜芦醇降低了细胞在H2O2刺激下活性氧的生成。8.在白藜芦醇作用下,细胞自噬相关蛋白水平升高,p62明显降低,mTOR磷酸化水平降低;白藜芦醇降低了焦亡相关蛋白的表达,NLRP3、Caspase-1与IL-1β表达水平明显降低;随着白藜芦醇给药浓度升高,施旺细胞TXNIP表达水平逐渐降低,mTOR磷酸化水平同样逐渐降低。研究结论:1.白藜芦醇具有促进神经挤压伤后神经运动功能的恢复。2.白藜芦醇是通过促进损伤后施旺细胞自噬,促进了损伤早期髓鞘降解过程,从而加速了神经再生速度;同时白藜芦醇还具有促进新生施旺细胞增殖的作用。3.白藜芦醇细胞毒性低,具有良好的临床应用前景。4.白藜芦醇通过抑制mTOR磷酸化促进了细胞自噬作用,降低了细胞氧化应激水平,减少了细胞焦亡;同时白藜芦醇直接通过减低细胞TXNIP表达水平降低细胞焦亡。创新点:1.首次证实白藜芦醇是通过促进自噬进而加速了早期髓鞘降解这一过程,并有促进新生施旺细胞增殖作用,促进了挤压伤后神经功能恢复。2.氧化应激条件下,白藜芦醇通过降低施旺细胞焦亡从而保护细胞,这种作用直接通过降低施旺细胞TXNIP表达水平来实现;同时也通过增加细胞自噬间接减少细胞焦亡。