肠缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I-R)损伤是一种反映急性应激及炎症反应的模型，在损伤过程中机体出现严重的能量代谢障碍和失控炎症反应。Leptin是一种由脂肪细胞分泌的、能够抑制摄食和促进能量消耗的因子；Orexin-A是一种由下丘脑侧部特异神经元分泌的、能够促进摄食并减少能量消耗的因子。由于它们都与能量代谢密切相关，而且以往的研究发现其浓度变化成相反的趋势，我们假设它们在肠I-R损伤所致的能量代谢障碍中发生一定的变化。我们通过在大鼠肠I-R损伤模型中检测它们的蛋白质及mRNA表达水平，探讨它们所发挥的炎性介质作用。主要的研究工作包括以下三个方面： 一、建立大鼠肠I-R损伤模型和样品的收集 1、大鼠随机分成六组，每组9只，分别为假手术组(Sham)、缺血60 min再灌注30 min组(I60’R30’)、I60’R90’组、I60’R150’组、I60’R240’组和I60’R360’组。麻醉后无菌条件下开腹并分离肠系膜上动脉，以微动脉夹夹闭60 min后松开，进行再灌注。 2、实验前行尾静脉取血作自身对照，实验时行心脏抽血，分离血清和血浆，分别用于检测Leptin和Orexin-A。抽血后立即取出左侧附睾脂肪垫和下丘脑组织，用于提取Leptin和Orexin-A及其总RNA。 二、肠I-R损伤对血清及脂肪组织Leptin水平的影响 1、采用本科室国内首创的鼠类Leptin放免分析法及作者设计的调整法测量血清及脂肪组织的Leptin浓度，结果发现：与损伤前自身对照组的血清水平相比，I60’R30’组显著降低，I60’R150’组呈现增高的趋势，而160’R360’组显著增高；与损伤后Sham组的血清水平相比，I60’R240’组呈现增高的趋势，而I60’R360’组显著增高；与损伤后Sham组的脂肪组肠翻益一再窟注费份二对沪枢蜜织姿办周应LePtin友口爬义in讨欢平必影时功戈商要.织水平相比，160’R3O’组、160’R90’组显著降低，而160’R360’组显著增高。 2、采用Westeo Blot法检测脂肪组织LePtin水平，结果发现:脂肪组织内LePtin蛋白水平较低，采用SDS一队GE及Westem Blot法检测仅出现微弱的LePtin发光条带，而且出现强非特异发光条带。 3、采用Rl:pCR法检测脂肪组织中LePtin mRNA表达水平，结果发现:与损伤后sham组相比，160’R3o’组、 160’咫40’组、160’R360’组LeptinmRNA水平显著增高，而160’R150’组显著降低。 三、肠I一R损伤对血浆及下丘脑Orexin一A水平的影响 1、我们在国内首创了人Orexin一A放射免疫分析法，由于人与大鼠的orexin一A结构一致，所以采用该放免法测量大鼠血浆及下丘脑的Orexin一A浓度，结果发现:与损伤前自身对照组的血浆水平相比，各实验组损伤后的血浆Orexin一A水平与之的差异均无显著性;与损伤后Sham组的血浆水平相比，其他各实验组损伤后的血浆Orexin一A水平与之的差异均无显著性;与损伤后Sham组下丘脑水平相比，各实验组损伤后的下丘脑Orexin一A水平与之的差异亦均无显著性。 2、采用RFPCR法检测下丘脑Orexin一A mRNA表达水平，结果发现:与损伤后Sham组相比，160’R30，组、160’R90’组orexin一A mRNA水平逐步降低，160’R15O’组最低，160’咫40’组、160’R360’组逐步回升。 通过上述实验结果，我们发现LePtin和Orexin一A的水平在肠I一R损伤所致的能量代谢障碍中发生了一定的变化:随着再灌注时间的延长，LePtin蛋白水平在中枢组织和外周血中呈对应的波动式变化，orexin-A蛋白水平在中枢组织和外周血中变化不显著;同时，两者的中枢组织mRNA表达水平都有显著性变化，并且呈相反趋势。因此，我们认为LePtin与Orexin一A这对呈相反变化趋势的活性因子对肠I一R损伤的应答具有时间依赖的效应，并可能在损伤后炎症反应的代谢紊乱中发挥一定的作用。