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刚地弓形虫隶属于顶端复合门,虫体呈弓形,由此命名为刚地弓形虫。弓形虫病是一种免疫抑制性疾病,弓形虫的侵袭作用除了虫体本身外,与宿主的免疫状态有着密切的关系,在宿主免疫功能低下时,弓形虫病能够造成严重损伤,但是直到现在也没有能够根治弓形虫病的药物,临床上使用的磺胺类药物只能对弓形虫速殖子形态有作用,对弓形虫引起的慢性感染没有较好的治疗效果,因此弓形虫疫苗的研制成为弓形虫研究的热点问题,对弓形虫的先天性免疫机制的理解显得尤为重要。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一组能够被不同的细胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,是生物体信号转导的重要组成部分,弓形虫棒状体蛋白38(Rhoptry protein 38,ROP38)可通过下调MAPK信号转导途径抑制宿主细胞的转录,ROP38在不同基因型虫株中的表达量是有差异的,在弓形虫速殖子向缓殖子转换过程中,ROP38可能扮有重要角色。目前学界对弓形虫的基础生物学研究已经很成熟,但是对弓形虫速殖子和缓殖子之间的转换机制尚不清晰,DCs对弓形虫的应答功能未见深入报道,在先天性免疫系统中占据重要作用的TLR4在弓形虫入侵产生的免疫应答中扮演什么样的角色仍有待于进一步探讨和研究。本论文首先对弓形虫RH株ROP38基因进行克隆与表达。采用PCR技术对弓形虫ROP38基因进行扩增和测序,目的基因的长度为516bp,接着将目的片段与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组质粒pGEX-4T-ROP38,重组质粒经IPTG诱导表达和纯化目的蛋白,为研究弓形虫核酸疫苗打下基础。其次研究了 TLR4介导DCs感染弓形虫ROP38抗原试验。试验分为3组每组3个重复,收集培养至第7d的树突状细胞于6孔细胞培养板中每孔1mL(1×106个/mL),其中TLR4抗体封闭组加入0.5mLTLR4抗体(终浓度为1 μg/mL)和1 mLROP38(0.28 mg/mL)重组抗原;弓形虫棒状体蛋白38处理组加入1 mL ROP38(0.28 mg/mL)和0.5mL完全培养基;空白对照组加入1.5mL完全培养基。37℃、5%CO2培养箱中培养2h后流式细胞仪检测CD11c+表达水平,Flowjo软件分析所得数据。结果表明,TLR4抗体未封闭组、TLR4抗体封闭组、空白对照组的CD11c+表达量分别为(69.0±2.7)%、(59.6±1.2)%、(22.1±0.6)%,同时采用SPSS软件经方差分析显示,TLR4抗体未封闭组与TLR4抗体封闭组的CD11c+表达水平差异显著(P<0.05),并且上述两试验组均空白对照组也差异显著(P<0.05)。最后体内试验探讨了 TLR4介导弓形虫感染小鼠试验。以弓形虫感染KM小鼠为模型分为四组,空白对照组、TLR4抗体封闭组、TLR4抗体未封闭组、弓形虫感染组。空白对照组不作处理,其余试验组各组小鼠分别腹腔注射弓形虫RH株速殖子1×104个,其中TLR4抗体未封闭组免疫ROP38蛋白疫苗,以评价ROP38蛋白疫苗的免疫保护作用;腹腔注射弓形虫RH株1×104个3d后进行T淋巴细胞增殖情况分析;以β-actin为内参基因,分析免疫相关因子的表达情况;免疫组织化学方法分析心脏,肺脏,肝脏组织感染弓形虫后TLR4表达情况。结果表明,TLR4抗体封闭组CD3+CD4+CD8-表达量(21.1±4.03)与空白对照组相(12.3±0.21)比差异不显著(P>0.05)而与TLR4抗体未封闭组(15.4±0.28)和弓形虫感染组(30.2±0.07)相比差异显著(P<0.05)并且TLR4抗体未封闭和弓形虫感染组之间差异显著(P<0.05);而TLR4抗体封闭组CD3+CD8+CD4-的表达量(8.21 ±0.18)与TLR4抗体未封闭组(13.8±4.7)之间没有差异,并且和空白对照组(4.4±0.01)与弓形虫感染组(15.6±0.14)之间差异显著(P<0.05),提示弓形虫感染小鼠可经过TLR4途径刺激机体产生高水平的T淋巴细胞,引起T淋巴细胞增殖。实时荧光定量PCR检测可知,弓形虫感染组中IL-12、IL-18和IFN-γ的表达量与TLR4抗体封闭组相比分别上调2.3、5.5和3.2倍,提示弓形虫可通过TLR4受体有效诱导Th1型细胞免疫应答,而弓形虫感染组和TLR4抗体未封闭组之间的差异提示ROP38疫苗能够起到一定的免疫保护作用。最后,免疫组织化学结果显示,各试验组中心脏,肺脏和肝脏T LR4表达量有差异,弓形虫感染组中表达量最高,其次为TLR4抗体未封闭组和空白对照组,TLR4抗体封闭组表达量最低。综上所述,我们可得出结论:TLR4受体介导ROP38刺激小鼠DCs成熟;TLR4受体可介导机体产生Th1型细胞免疫应答以抵抗弓形虫感染,这些研究为弓形虫先天性免疫机制奠定基础,为今后研制抗弓形虫感染疫苗助力。