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本文以成年绵羊为实验材料,进行玻璃化冻存羊软骨细胞的研究。研究了二甲基亚砜(DMSO)对羊软骨细胞的应用浓度范围,并在此基础上设计了玻璃化溶液;根据不同预平衡时间和温度对羊软骨细胞存活率的影响,分析各组玻璃化溶液对软骨细胞的毒性,筛选出最佳预平衡方法;通过对冻存后羊软骨细胞的膜完整性和细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性变化的检测分析低温对羊软骨细胞的影响。(1) DMSO对羊软骨细胞的毒性分析:DMSO是一种具有易玻璃化和高渗透性的渗透性冷冻保护剂,但对细胞的毒性受温度和浓度的影响比较大。在浅低温(-20℃~4℃)时,DMSO作为冷冻保护剂的最佳初始浓度为10%~20%。在深低温时,DMSO作为羊软骨细胞保护剂的最佳应用浓度范围为10%~45%。(2)预平衡温度和时间的筛选:经过对预平衡时间和温度对细胞存活率的影响进行研究发现,玻璃化溶液在20℃下对羊软骨细胞的影响要比0℃大,因此预平衡温度设定在0℃;而细胞的存活率的变化趋势基本上是随预平衡时间的延长而降低,分析表明2 min为最佳平衡时间。(3)玻璃化溶液的筛选:从羊软骨细胞的回收率、存活率和SDH的活性变化分析,认为玻璃化溶液VS1和VSb的冻存效果最好,其中VS1的成分:10% DMSO、16%乙二醇、9%丙三醇、12%乙酰胺、3%聚乙二醇和0.6 M蔗糖;VSb的成分:14% DMSO、16%乙酰胺、2%聚乙二醇和0.15 M海藻糖。(4)玻璃化冻存后细胞活性的变化:对冻存后羊软骨细胞的回收率、膜完整性和SDH活性进行了初步研究,从各项指标来看,细胞的回收率和细胞膜完整性随着冻存时间的延长而逐渐下降,但下降速度不明显。SDH活性在玻璃化冻存1~20 d变化幅度较大,20~30 d下降趋势减弱,保持相对稳定。表明该玻璃化冻存方法适用于长期冻存羊软骨细胞。上述实验结果表明,羊软骨细胞玻璃化冻存时,在0℃预平衡2 min,辅以适当配比的玻璃化溶液,采用直接投入液氮快速降温法和37℃快速复温的手段,可获得较好的冷冻效果。