土壤盐碱化是困扰农业生产的一大难题,提高作物的耐盐碱胁迫能力成为解决这一问题的关键。小麦是我国乃至全球最重要的粮食作物之一,研究其耐盐碱的分子机制,提高其盐碱胁迫抗性具有重要的经济社会意义。山融4号（SR4）是本实验室前期通过小麦与长穗偃麦草不对称体细胞杂交得到的一个耐盐碱小麦渐渗系新品系。对SR4的小RNA测序筛选到了许多盐碱胁迫差异表达的miRNA,通过降解组测序和软件预测,筛选到了许多miRNA的潜在靶基因,其中谷胱甘肽转移酶家族中的TaGSTU6是盐碱胁迫响应miRNA novel395的潜在靶基因。本论文首先验证了 miRNA novel395与TaGSTU6的靶关系,并对TaGSTU6在小麦响应非生物胁迫中的功能及作用机制进行了研究,为其在小麦育种改良中的应用奠定基础。1.MiRNA novel395 与TaGSTU6靶标关系的验证许多研究已证明miRNA不但能参与调控植物中许多生长发育过程,也在非生物胁迫响应中起作用。我们首先验证了 miRNA novel395与TaGSTU6之间是否存在直接的靶标关系。荧光素酶报告基因检测系统是目前研究靶向关系的常用手段,结果显示TaGSTU6的表达受到miRNA novel395的负调控,表明两者之间可能存在靶向调控关系。2.TaGSTU6的功能研究TaGSTU6的ORF为726 bp,编码242个氨基酸。生物信息学分析发现TaGSTU6具有GST家族经典的两个保守结构域。通过酶活性分析发现TaGSTU6能催化其底物CDNB与还原型谷胱甘肽GSH发生反应,其催化能力约为阴性对照的12倍左右,证明TaGSTU6具有较强的GST酶活性。亚细胞定位显示TaGSTU6在细胞质、细胞核和细胞膜中均有定位。qRT-PCR分析发现,在JN177和SR4分别经过盐、碱、PEG、ABA以及H2O2处理后,TaGSTU6表达量均出现明显下调。为了明确TaGSTU6在小麦应对非生物胁迫中的功能,我们构建了TaGSTU6的过量表达及RNAi小麦株系,同时也构建了TaGSTU6的拟南芥异源过量表达株系。研究发现在小麦中组成型过量表达TaGSTU6导致植株对NaCl、高pH、NaHCO3、ABA、MV均表现为敏感表型,而TaGSTU6的RNAi小麦株系则出现了与上述过表达株系相反的表型,均表现出不同程度的抗性,这说明TaGSTU6参与了小麦对非生物胁迫的响应。与小麦过表达系类似,TaGSTU6的拟南芥过表达株系对NaCl、高pH、NaHCO3、ABA、MV也表现出敏感表型。这些结果说明TaGSTU6负调控植物对非生物胁迫的抗性。3.TaGSTU6参与植物抗逆的机制研究通过qRT-PCR检测了过表达拟南芥中ROS相关marker基因的表达,结果显示与ROS合成相关的一些基因表达上调,ROS清除相关酶表达量下降。此外,一些与离子通道转运相关的基因,比如AtSOS2,AtSOS3,AtNHX1的表达量也出现了显著变化。TaGSTU6过表达小麦的DAB和NBT染色结果显示,与对照相比过表达小麦叶片染色颜色更深而RNAi小麦株系的叶片染色相比对照要浅。同样,TaGSTU6拟南芥过表达株系的DAB和NBT染色相对Col-0要深。这些结果表明,TaGSTU6确实能够响应非生物胁迫,而且可能因为影响了 ROS平衡从而影响植物的胁迫抗性。同样,我们也检测了过表达拟南芥中ABA相关marker基因的表达,发现调控ABA含量以及一些下游响应基因的表达量都发生了明显变化。为深入了解TaGSTU6的抗逆机制,我们通过酵母双杂交以筛选它潜在的互作蛋白,从中挑选到了两个互作蛋白TaVOZ1（锌指转录因子蛋白）和TaSnRK1（丝氨酸苏氨酸蛋白激酶）。TaSnRK1、Ta VOZ1被报道能够参与植物的生长发育和响应环境胁迫。后续双分子荧光互补实验（BiLC）进一步验证了 TaGSTU6和TaVOZ1,TaSnRK1之间确实存在互作。