研究背景脑卒中(cerebral stroke)是各种诱发因素导致脑内动脉闭塞、破裂而造成脑部血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病,分为缺血性、出血性两种。脑卒中作为世界上致死率最高的疾病之一,全球每年新发病例高达1030万,且近来有年轻化的趋势,给社会、家庭和患者带来极大的负担。更严重的是,许多其他疾病会直接或间接导致脑卒中的发生。例如糖尿病就是引起脑血管疾病的独立危险因素,据国外资料显示,有糖尿病史患者同时患脑血管疾病的概率达到了 30～40%,而且糖尿病合并脑卒中的患者已经达到非糖尿病患者的2倍以上。临床上糖尿病合并脑卒中的患者中缺血性脑卒中占到了 80%,糖尿病并发卒中的发病率快速上升。因此如何设计和开发安全有效的脑卒中治疗药物,尤其是糖尿病脑卒中是一个亟待解决的问题。众多研究资料表明,吸入性麻醉药预处理或后处理可以保护神经系统减轻缺血性损伤。有学者发现七氟烷预处理能够减少动脉阻塞导致的脑梗死体积和凋亡细胞。许多脑缺血再灌注损伤动物模型实验证明,七氟烷预处理可以有效减少神经细胞的凋亡、一定程度改善脑梗死体积、神经功能评分、炎性反应等方面从而保护脑神经。但我们并不清楚糖尿病是否会影响七氟烷后处理的神经保护作用,且七氟烷发挥作用的机制也有待研究。有学者发现糖尿病大鼠通过恢复海马突触功能和Na+,K+-ATP酶的活性提高学习和记忆能力,机制可能与PI3K/Akt信号通道有关;Yang和同事发现利拉鲁肽可以激活糖尿病大鼠PI3K/Akt信号通道,促进自噬,最终对慢性2型糖尿病相关的学习记忆障碍提供保护;另有研究已经证实糖尿病大鼠大脑皮层细胞中PI3K/Akt信号通道相关蛋白的表达量明显下降。因此,有必要进行七氟烷对糖尿病大鼠脑缺血后神经损伤影响的研究,以期发现七氟烷后处理对脑缺血再灌注糖尿病大鼠神经功能损害是否有效,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制,为后期降低糖尿病人群脑缺血后神经功能损害及促进脑卒中后神经功能恢复提供理论依据。研究目的本文通过构建脑缺血合并糖尿病大鼠模型,评估七氟烷后处理对合并糖尿病的大鼠在脑缺血再灌注后,脑组织损伤程度及氧化应激和细胞凋亡的影响,以及PI3K/Akt信号通道在七氟烷后处理中的作用机制做初步探究。研究方法1.研究对象及分组:健康Wistar大鼠288只,体重(260±30)g。大鼠饲养于室温20±2℃,相对湿度50%～70%的清洁环境中,自由摄食、摄水,适应性饲养一周后,进行实验分组和脑缺血糖尿病模型制备。首先取其中240只大鼠随机分为6组(每组40只),正常组(Control):不做处理;糖尿病组(DM):选取糖尿病造模成功后大鼠;脑缺血模型组(CI):采用线栓法将健康大鼠大脑中动脉血流阻断2h后恢复灌注;糖尿病脑缺血模型组(DMCI):阻断糖尿病大鼠大脑中动脉血流2h后恢复灌注;七氟烷后处理组(SCI):健康大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min;糖尿病七氟烷后处理组(SDMCI):糖尿病大鼠缺血再灌注开始时立即给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min。Control、DM、CI和DMCI组大鼠均在再灌注开始时给予100%氧气,持续30 min,大鼠再灌注24h后进行相应指标检测。2.建立糖尿病和脑缺血大鼠模型:大鼠高脂高糖饮食,喂养5周后,腹腔注射STZ(链脲佐菌素,Streptozotocin,溶解于柠檬酸缓冲液中,25mg/kg)每天一次,连续2d。72h后尾静脉采血测空腹血糖,以血糖≥16.7mmol/L,并出现多食、多尿、多饮为大鼠糖尿病模型成立。脑缺血大鼠模型构建方法:大鼠术前12h禁食。腹腔内注射10%水合氯醛麻醉大鼠,仰卧位固定,手术暴露右颈总动脉,在分叉处分离颈内动脉和颈外动脉,用4/0尼龙线阻断大脑中动脉,2h后抽出尼龙线,开放大脑中动脉,恢复缺血区灌注。模型成功建立的标志是:大鼠手术后清醒,左侧肢体出现偏瘫,以左上肢较为明显;提尾悬挂时左上肢呈现蜷缩屈曲;下地行走时向左侧转圈跌倒,不能正常直行。3.LY294002脑室内注射给药:为了研究七氟烷治疗脑缺血再灌注中PI3K/Akt通道的作用,用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002预处理七氟烷治疗组大鼠。取其余48只大鼠,将大鼠分为6组(每组8只),分别构建正常脑缺血加生理盐水组(NS-CI)、糖尿病合并脑缺血加生理盐水组(NS-DMCI),七氟烷后处理脑缺血加生理盐水组(NS-SCI)、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加生理盐水组(NS-SDMCI)、七氟烷后处理脑缺血加抑制剂组(LY-SCI)、七氟烷后处理糖尿病脑缺血加抑制剂组(LY-SDMCI)大鼠模型。术前将LY294002溶于二甲基亚砜(DMSO)和乙醇中,终浓度为10mM。将大鼠用10%水合氯醛(350mg/kg,腹腔给药)麻醉。LY-SCI组和LY-SDMCI组在建立缺血模型术前30min,在缺血侧脑室注射10μl LY294002溶液,其他组大鼠麻醉后侧脑室注射10μl生理盐水作为对照。NS-SCI组、NS-SDMCI组、LY-SCI组、LY-SDMCI组缺血2h后恢复灌注时给予给予大鼠2.6%的七氟烷吸入,持续30min:NS-CI组、NS-DMCI组再灌注开始时给予100%氧气,持续30min。4.指标检测:对于神经功能评估,采用Longa的5级4分法,在动物麻醉清醒后24h进行评分并记录神经功能缺失症状;对于脑梗塞体积评估,采用TTC染色法并利用ImageJ软件进行计算;通过计算脑组织干/湿重比值评估大鼠脑水肿程度;对于大鼠大脑组织形态学变化,采用HE染色在光学显微镜下进行观察;对于大鼠神经学习能力的检测,采用Morris水迷宫实验进行测定;对于大鼠血清中的 S100B、Bcl-2、Bax、GSH-PX、Caspase-3 和 SOD 的含量,采用 ELISA试剂盒进行检测;对于大鼠血清中NOS活性和NO含量,采用比色法进行检测;western blot检测脑组织中PI3K/Akt通道相关蛋白的磷酸化水平。5.统计学方法分析:应用SPSS19.0统计学软件对各项检测数据进行数据分析,所有分析数据结果均以均数±标准差(mean±SD)表示,两组间数据分析采用t检验,多组间数据分析采用单因素方差分析(ANOVA),事后分析采用LSD-t检验,两组间数据采用双变量Pearson进行相关性分析,以P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.七氟烷后处理可以减弱大鼠缺血性脑损伤。各脑缺血组大鼠与Control组相比脑梗死体积、Longa神经缺陷评分和脑含水量均增加(P<0.05),且DMCI组大鼠的上述指标较CI和DM组大鼠有进一步增加(P<0.05)。七氟烷治疗降低了 SCI和SDMCI组的脑梗死体积、Longa分值和脑含水量(P<0.05)。结果表明七氟烷后处理减弱了 SCI和SDMCI组大鼠的缺血性脑损伤,对神经系统有保护作用。2.七氟烷后处理能改善脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。利用Morris水迷宫来评估大鼠的空间学习和记忆功能,结果显示与Control组相比,其他脑缺血组别的大鼠逃避潜伏期时间明显延长,穿越平台次数显著降低(P<0.05)。而相比于CI和DMCI组,再灌注开始时吸入七氟烷的大鼠(SCI组和SDMCI组)逃避潜伏期时间明显减少,穿越平台次数显著增加(P<0.05),并且可以在更短的时间内在导航测试中找到平台(P<0.05)。这些结果表明:七氟烷后处理改善了脑缺血糖尿病大鼠的空间学习和记忆能力。3.七氟烷后处理减轻了脑缺血糖尿病大鼠的脑组织形态学损伤。HE染色结果显示,对照组的大鼠脑组织由健康神经细胞组成,没有细胞肿胀、膜起泡、核浓缩、破碎溶解。与Control组和DM组相比,CI组的大鼠脑组织切片显示出坏死,神经元丢失,核固缩,神经元收缩和星形细胞肿胀。此外,与CI组相比,DMCI组显示出更严重的损伤。经过七氟烷后处理后,SCI组和SDMCI组的大鼠的组织损伤有明显的改善。4.七氟烷后处理减少脑缺血糖尿病大鼠的氧化应激反应。为了探究七氟烷的神经保护作用是否与其抗氧化特性有关,我们检测了内源性抗氧化酶SOD和GSH-PX的活性,以及NOS和NO的水平。与Control组相比,CI组的SOD和GSH-PX水平降低(P<0.05),而DMCI组中二者表达水平进一步降低(P<0.05)。与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组中SOD和GSH-PX含量明显增加(P<0.05)。七氟烷可以显著增加SCI和SDMCI组的大鼠的SOD和GSH-PX的表达。另一方面,NOS和NO的表达水平在CI组中有所增加(P<0.05),并在DMCI组中进一步增加(P<0.05),但经七氟烷后处理二者的表达水平显著降低(P<0.05),这些结果表明七氟烷可以防御SCI和SDMCI组中大鼠的氧化损伤。5.七氟烷后处理可减弱脑缺血糖尿病大鼠脑组织的细胞凋亡。缺血再灌注后,血清中促凋亡因子Bax和Caspase-3在CI和DMCI组中的表达上调(P<0.05),但在七氟烷治疗组中表达下调(P<0.05)。另一方面,抗凋亡因子Bcl-2的表达水平在CI组相比于Control组有所降低(P<0.05),在DMCI组中Bcl-2的表达水平进一步降低(P<0.05)。与CI和DMCI组相比,七氟烷可以显著提高Bcl-2的表达(P<0.05)。这些结果表明:七氟烷通过在脑缺血大鼠脑组织中抑制细胞凋亡来减轻缺血性脑损伤。6.七氟烷后处理组大鼠的S100B蛋白水平显著降低。相比与对照组,各脑缺血组大鼠血清中S100B的浓度显著升高(P<0.05),且DMCI组S100B的含量高于CI组和DM两组(P<0.05),表明合并糖尿病可以加重大鼠缺血后再灌注造成的脑损伤。经七氟烷吸入治疗后,与CI和DMCI组相比,SCI和SDMCI组的S100B水平明显降低(P<0.05)。7.S100B蛋白水平与氧化损伤指标的相关性分析显示:S100B蛋白表达量与Longa神经功能缺陷评分、脑梗死体积、含水量、NOS、NO、Bax和Caspase-3呈正相关(P<0.01),与SOD、GSH-PX和Bcl-2呈负相关(P<0.01)。说明血清S100B可以作为评价大鼠脑缺血损伤的可靠指标,提示七氟烷后处理可以减轻大鼠脑缺血引起的脑损伤程度。8.七氟烷后处理显著增加PI3K/Akt通道活性。Western blot实验结果显示脑缺血大鼠中PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平与Control组相比明显降低(P<0.05),DMCI组大鼠p-PI3K、p-Akt的含量低于CI组和DM组(P<0.05)。而与CI和DMCI组相比,用七氟烷后处理后,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比例明显增加(P<0.05)。表明七氟烷可能通过PI3K/Akt信号通道的激活来发挥作用。9.阻断PI3K/Akt信号通道可以减弱七氟烷对氧化应激和凋亡的保护作用。用PI3K/Akt通道抑制剂LY294002注射大鼠,检测血清中氧化应激和细胞凋亡相关因子水平的变化。七氟烷可以使脑缺血和糖尿病合并脑缺血的大鼠血清促凋亡因子Bax、Caspase-3水平降低(P<0.05),并可以使凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白含量升高(P<0.05);当同时用LY294002处理大鼠后,七氟烷的作用变得不明显,血清Bax、Caspase-3、Bcl-2的含量与处理前变化不大(P<0.05)。类似地,脑缺血与糖尿病合并脑缺血的大鼠再灌注开始时吸入七氟烷可以改善缺血引起的抗氧化因子SOD和GSH-PX水平下降(P<0.05),使它们的表达量大幅度升高;且代表氧化程度的NOS和NO水平与未经七氟烷处理的大鼠相比较也有所下降(P<0.05)。而LY294002的引入减弱了七氟烷的这种治疗效果,使血清SOD、GSH-PX、NOS和NO的含量均接近未吸入七氟烷治疗的缺血再灌注大鼠(P<0.05)。说明阻断PI3K/Akt信号通道可以抑制七氟烷的治疗效果,进一步验证了七氟烷是通过激活PI3K/Akt通道发挥保护作用。结论七氟烷后处理可显著改善糖尿病大鼠缺血再灌注时造成的脑损伤并很可能通过激活PI3K/Akt信号通道,抑制脑神经元细胞内的氧化应激反应和细胞凋亡从而发挥对大鼠脑缺血性神经损伤的保护作用。