鲫鱼PKR-like Za结构域的表达及其与核酸亲和性分析

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PKR是由干扰素(IFN)诱导产生的、依赖双链RNA(dsRNA)激活的蛋白激酶,在哺乳动物细胞中广泛存在。鲫鱼类PKR基因(CaPKR-like)是第一个报道的非哺乳类PKR同源物,其全长cDNA序列为2192bp,编码一个由513个氨基酸残基组成的蛋白质(CaPKR-like);CaPKR-likeC-端为典型的激酶催化区,N-端是功能调节区,但在N-末端没有哺乳类PKR典型的dsRNA结合结构域(dsRBM),取而代之的是两个Z-DNA结合结构域(Zα)。 为了进一步了解CaPKR-likeN-末端的功能,本文根据已知序列设计引物,从紫外线灭活GCHV诱导的SMART-cDNA文库中克隆到了包含Zα结构域的三种cDNA。并经原核表达获得了包含Zα结构域的三种融合多肽(PZα1、PZα2和PZα1Zα2),表达产物经过了亲和层析纯化。凝胶阻滞实验表明,PZα1、PZα2及两者的混合物均不能与双链RNA(PolyI∶C)和DNA结合,而PZα1Zα2与PolyI∶C及DNA有明显的结合现象;而且随PZα1Zα2浓度的增加,PolyI∶C在琼脂糖凝胶电泳中产生的阻滞作用越明显;同时也发现,PZα1、PZα2和PZα1Zα2在体外均能形成二聚体,但PZα1的二聚化现象相对较弱。 此外,用纯化的PZα1Zα2免疫家兔,制备了多克隆抗体,采用蛋白质印迹法(Westernblotting)分析了CaPKR-like在鲫鱼各组织及鲫鱼囊胚细胞(CAB)中的表达情况。实验结果表明,CaPKR-like在经PolyI∶C诱导的鲫鱼各组织都有一定水平的表达;而且在经PolyI∶C诱导的鲫鱼囊胚细胞中的表达水平较未经诱导的对照强。
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