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多西他赛,属于紫杉烷类抗癌药物,临床对于乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、头颈癌等癌症具有显著疗效。市售注射制剂采用吐温-80和乙醇做助溶剂,易产生溶血和过敏等不良反应,这些因素限制了多西他赛在临床治疗中的应用。针对上述问题,本研究设计构建一种可被肿瘤组织分泌的基质金属蛋白酶MMP-2/9所激活的细胞穿膜肽(activatable cell-penetrating peptide,ACPP)和叶酸双重修饰的新型多西他赛纳米脂质载体,提高多西他赛抗肿瘤效果,同时降低毒副作用。 首先,成功设计了兼具肿瘤组织靶向传递和细胞高效穿透功能的ACPP,该结构分为三个部分:包括聚阳离子域(细胞穿膜肽部分)、底物肽域(MMP-2/9酶可裂解部分)、聚阴离子域(衰减肽部分)。采用HPLC法,对ACPP的酶解行为进行研究。通过亲核取代反应和迈克尔加成反应成功合成了 DSPE-PEG2000-ACPP、DSPE-PEG2000-CPP和DSPE-PEG5000-Folate。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)证实了产物的生成。 采用乳化-超声法制备了PEG化的CPP,ACPP,ACPP和叶酸共同修饰的多西他赛纳米脂质载体。以香豆素-6作为体外细胞水平的示踪剂,制备了包载香豆素-6的被动靶向和主动靶向的纳米脂质载体,进行了制剂体外细胞水平的定性和定量研究。以羰花青荧光染料DiR为近红外探针,制备了包载DiR的各组纳米脂质载体,用于活体成像实验,研究给药系统肿瘤靶向和组织分布情况。所制备的纳米脂质粒径为30-40 nm,PDI小于0.15,粒径小且分布均一,包封率均在95％以上,4℃放置1个月内稳定性良好。差示扫描量热法证明药物被包裹在纳米脂质载体中,制剂的相对结晶度有所减低,内部结构中不规则的无定形态比例有所增加,体外释放结果显示,多西他赛纳米脂质载体具有明显的缓释特征。 选择高表达叶酸受体的KB细胞,具有一定叶酸受体表达的MCF-7细胞,没有叶酸受体表达的A549细胞以及过度分泌基质金属蛋白酶 MMP-2/9的HT-1080细胞作为模型,对PEG化的叶酸以及ACPP修饰的多西他赛纳米脂质载体的体外活性进行评价。通过流式细胞仪考察叶酸和ACPP对纳米脂质载体细胞摄取能力的影响,通过激光共聚焦显微镜考察制剂在细胞内的定位和分布,初步探讨纳米脂质载体细胞内化的机理。研究发现,ACPP与叶酸共同介导可以显著提高KB、MCF-7和HT-1080细胞对纳米脂质载体的摄取,摄取的程度受细胞表面叶酸受体的表达和MMPs分泌水平的影响。两者对A549细胞的摄取影响不大。在外加MMPs的情况下,ACPP和叶酸修饰的纳米脂质载体呈现最强的细胞靶向性和最高效的跨细胞转运能力。激光共聚焦显微镜观察发现,进入胞内的双修饰纳米脂质载体主要分布于细胞浆中。 对多西他赛纳米脂质载体进行体外细胞毒性评价,包括:(1)MTT细胞毒实验:叶酸和ACPP修饰的纳米脂质载体(F/ACPP-DTX-NLC)增强了多西他赛对KB细胞、MCF-7细胞和HT-1080细胞的杀伤作用。(2)Annexixin V/PI细胞凋亡诱导实验:主动靶向的多西他赛纳米脂质载体使两种细胞早期凋亡和晚期凋亡的数量均有所提高。(3)细胞周期实验:随着多西他赛药物浓度的增加,给药时间的延长,KB和HT-1080细胞中DNA被阻滞在G2/M期的比例增大。结果表明,F/ACPP-DTX-NLC对肿瘤细胞的生长抑制作用和诱导凋亡作用最强。建立KB细胞和HT-1080三维体外细胞肿瘤球模型,考察药物对实体瘤无血管部分的影响。研究表明,叶酸和ACPP共同修饰的多西他赛纳米脂质载体可明显增强多西他赛对KB和HT-1080肿瘤球生长的抑制作用和穿透能力。 以 Spraque-Dawley大鼠为研究对象,尾静脉注射 Taxotere?、DTX-NLC和F/ACPP-DTX-NLC,考察多西他赛体内的药物动力学。结果显示,与市售制剂Taxotere?相比,多西他赛纳米脂质载体能够在循环系统中维持更高的血药浓度,延长体内的滞留时间。 以皮下接种KB和HT-1080细胞的荷瘤BALB/c裸鼠为模型,采用活体成像技术,在体实时观察游离DiR,DiR-NLC和F/ACPP-DiR-NLC在体内组织分布情况,48小时后处死动物,取出主要脏器以及肿瘤组织进行离体成像实验。结果表明,PEG化叶酸和ACPP的修饰提高了纳米脂质载体对肿瘤组织的靶向性,有利于药物在肿瘤部位蓄积。 采用KB细胞皮下接种荷瘤BALB/c裸鼠动物模型,考察了尾静脉注射多西他赛系列制剂 Taxotere?, DTX-NLC,ACPP-DTX-NLC, CPP-DTX-NLC, F-DTX-NLC和F/ACPP-DTX-NLC的抗肿瘤效果。通过原位末端转移酶标记技术(TUNEL)考察诱导组织细胞凋亡的作用。采用免疫组化法对肿瘤组织细胞的微管蛋白进行标记研究。结果发现,F/ACPP-DTX-NLC能够显著增加肿瘤细胞的凋亡;提高对肿瘤细胞的微管蛋白的解聚抑制作用,显著增加多西他赛抗肿瘤生长抑制作用。 抗肿瘤治疗过程中,以生理盐水组为对照,观察各制剂组裸鼠体重变化、血红蛋白含量、白细胞计数、粒细胞计数,结果表明血象指标均在正常范围内。相比之下,Taxotere?组由于骨髓抑制作用和溶血性造成骨髓有核细胞减少,体重下降明显。多西他赛纳米脂质载体较 Taxotere?具有更好的耐受性和更低的毒副作用。 综上所述,本研究成功构建了PEG化叶酸和ACPP共同修饰的多西他赛纳米脂质载体,进行制剂学表征。叶酸和ACPP的共同修饰提高了多西他赛纳米脂质载体对肿瘤细胞的靶向内化作用,增强了增殖抑制作用,对肿瘤组织具有穿透能力,提高肿瘤组织与肿瘤细胞中的药物浓度,进而提高了抗肿瘤治疗效果,在恶性肿瘤靶向治疗研究领域开辟了新途径。