肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)是革兰阴性兼性胞内寄生菌,主要寄生在人和动物的肠道内,可引起胃肠炎甚至严重的全身性感染,是重要的人兽共患病病原菌。肠炎沙门菌有周身鞭毛和菌毛,可以运动。菌毛可以调节细菌与宿主的相互作用,与细菌的致病性、生物膜的形成、运动性、黏附和肠道定殖有关,同时也是肠炎沙门菌中重要的毒力因子之一。在本实验室前期研究中,利用SCOTS技术在筛选和鉴定肠炎沙门菌感染RAW264.7和HD-11巨噬细胞的过程中发现：IpfC和stdB基因在胞内的转录水平显著高于体外培养状态,这两个基因分别属于Lpf长极性菌毛操纵子和Std菌毛操纵子家族,但国内外对两基因的功能研究鲜有报道。本研究利用同源重组的方法成功构建了肠炎沙门菌C50041的IpfC、stdB基因缺失株及回复株,评价了缺失株和回复株的生物学特性,比较其与野生株在感染细胞能力、同一家族其它基因表达量及小鼠致病能力等方面的差异,初步探讨了肠炎沙门菌在感染宿主过程中IpfC和stdB基因发挥的作用。1肠炎沙门菌C50041ΔlpfC和C50041ΔstdB缺失株的构建与鉴定本文利用自杀质粒介导的同源重组技术构建了肠炎沙门菌C50041株的IpfC和stdB基因缺失株C50041ΔlpfC和C50041AstdB。同时,分别将IpfC和stdB基因克隆至质粒pBR322并电转入缺失株中,构建了回复株C50041ΔlpfCR和C50041AstdBR。比较野生株C50041、缺失株C50041ΔlpfC、C50041ΔstdB及回复株C50041ΔlpfCR和C50041ΔstdBR的基本生物学特性。生物学特性分析显示：IpfC和stdB基因的缺失不影响C50041的生长特性和生化特性,且两缺失株具有良好的遗传稳定性。但是缺失株C50041ΔlpfC对BALB/c小鼠的LD50是野生株的2倍,缺失株C50041ΔstdB对BALB/c小鼠的LD50是野生株的三分之一。IpfC基因的缺失使肠炎沙门菌对BALB/c小鼠的毒力有所降低,而stdB基因的缺失使肠炎沙门菌刘BALB/c小鼠的毒力有所增强,这为进一步研究肠炎沙门菌Lpf和Std菌毛的功能奠定了基础。2肠炎沙门菌stdB基因功能的初步研究本研究通过体外细胞感染实验、细胞因子和菌毛操纵子其它基因表达量的检测及小鼠体内细菌动态分布实验等开展对肠炎沙门菌stdB基因的功能初步研究。实验结果表明：缺失株对细菌的运动力没有影响,但是对IPEC-J2细胞黏附和侵袭的能力极显著减弱(p<0.01),同时驿RAW264.7的侵袭能力有显著性差异(p<0.05)。利用RT-PCR方法发现体外培养试验结果和体外感染细胞RAW264.7试验结果中缺失株的stdA、stdC和stdF基因表达量都降低。用C50041、C50041ΔstdB和C50041ΔstdBR分别黏附和侵袭RAW264.7细胞后,利用RT-PCR方法测定了炎性因子的表达量变化,在此过程中IL-12的表达量都是极显著性降低(p<0.01)。在CBA小鼠动物感染模型试验结果中显示,缺失株和野生株分别感染CBA小鼠后的肠系膜淋巴结、派尔氏结、脾脏、肝脏和盲肠从2.5天到25天的变化规律几乎是一致的,在5天时比较肠系膜淋巴结的带菌量有显著性差异(p<0.05)；肠炎沙门菌stdB基因缺失后,可以使其在CBA小鼠盲肠内的定殖能力下降。本研究为开展肠炎沙门菌stdB基因的功能研究奠定了基础。3肠炎沙门菌IpfC基因功能的初步研究本研究通过电镜观察、体外细胞感染、细胞因子和小鼠体内细菌动态分布等实验,对肠炎沙门菌定殖、致病、运动等能力进行研究。实验结果表明：IpfC基因与肠炎沙门菌菌毛的形成有关,缺失株运动能力和野生株相比有一定程度下降但无显著性差异,对RAW264.7和HD-11两种巨噬细胞侵袭能力变弱,对PEC-J2肠上皮细胞黏附能力减弱。利用RT-PCR方法发现体外培养试验结果和体外感染细胞RAW264.7试验结果中缺失株的IpfA、IpfB和IpfD基因表达量都降低。用C5004、C50041ΔlpfC和C50041ΔlpfCR分别黏附和侵袭RAW264.7细胞后,利用RT-PCR方法测定了炎性因子的表达量变化,缺失株黏附和侵袭RAW264.7细胞时IL-12的表达量都是极显著性降低(p<0.001),IL-6的表达量只在黏附时是极显著性降低(p<0.001)。在CBA小鼠动物感染模型试验结果中显示,在5天时比较分别感染缺失株和野生株的派尔氏结带菌量有显著性差异(p<0.01),缺失株感染后不同监测点派尔氏结的带菌都不同程度增多,我们推测IpfC基因可能与肠炎沙门菌进入CBA小鼠的派尔氏结有关。同时肠炎沙门菌IpfC基因缺失后,使肠炎沙门菌在盲肠的定殖能力减弱。本文初步阐明IpfC基因对肠炎沙门菌侵袭宿主及致病性有一定作用。