天然橡胶是我国重要的战略物资,对我国的经济及国防建设具有重要意义。橡胶树炭疽病是橡胶树的一种重要叶部病害。其病原菌主要有胶孢炭疽菌复合群和尖孢炭疽菌复合群。我国橡胶树炭疽菌以胶孢炭疽菌复合群中Colletotrichum siamene为主要致病菌。前期研究表明 HOG MAPK(High Osmolarity Glycerol Mitogen-ActivatedProtein Kinase)信号途径是真菌应对渗透压等各种胁迫反应所必须的,该途径与炭疽菌对咯菌腈等吡咯类杀菌剂敏感性密切相关,但其如何调控对咯菌腈的敏感性仍是未知的。本研究通过酵母双杂交技术、His Pull-down技术、荧光定量PCR技术对橡胶树炭疽菌(C.siamense)Hog1和Pbs2互作蛋白进行筛选和鉴定。为后续分析这些蛋白具体参与那些功能,特别是致病性和抗药性功能的研究提供基础。另一方面也为进一步分析HOG MAPK信号途径网络成员提供基础。主要研究结果如下:1、成功构建橡胶树炭疽菌cDNA文库。该文库包含外源片段率为83.3%,片段大小主要集中在400-2000 bp,文库滴度为6.52×105 cfu/mL,可进一步开展酵母双杂交实验。2、克隆获得橡胶树炭疽菌HOG MAPK信号途径关键成员CsPbs2和CsHog1基因序列。对基因和氨基酸序列的分析显示,CsHog1基因序列包含完整的开放阅读框架数据,DNA序列大小为1383 bp(登录号:MG887856),cDNA序列大小为1080 bp(登录号:MG887857),该基因含有5个内含子,编码459个氨基酸;CsPbs2基因的DNA序列大小为2051 bp(登录号:AMA19670.1),cDNA序列大小为2004 bp(登录号:AMA19670.1),该基因含有1个内含子,编码667个氨基酸。两蛋白都含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc。3、从橡胶树炭疽菌cDNA文库中筛选出与CsPbs2互作的蛋白有31个,它们主要有细胞色素P450,细胞色素b5,组蛋白H3,泛素活化酶E1蛋白,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,SSK1蛋白等;与CsHog1互作的蛋白有33个,主要有细胞壁蛋白PhiA,β-葡糖苷酶、乙二醛氧化酶前体,GP5包膜蛋白等;其中与CsPbs2和CsHog1都互作的蛋白有6个,它们分别是bys1结构域蛋白,苏氨酸脱氢酶,β-葡糖苷酶,甲基转移酶,假定蛋白和一个未知蛋白。4、His-Pull down技术进一步证实细胞色素P450(CsP450)、细胞色素b5(Cscytb5)与CsPbs2蛋白存在互作关系。5、利用qRT-PCR技术,分析了咯菌腈对基因表达量的影响。与对照相比,经杀菌剂咯菌腈处理后CsPbs2、CsHog1极显著上调表达。而Cscytb5和CsP450基因有极显著下调表达趋势,其中CsPbs2、CsHog1在药剂处理2h、4h、8h后均极显著上调表达,Cscytb5基因和CsP450基因在咯菌腈处理4 h和8 h时极显著下调表达。研究结果说明CsPbs2、CsHog1、Cscytb5和CsP450基因表达受到咯菌腈药剂影响。