研究背景苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene)是多环芳烃(PAHs)中最具有代表性的化学物,是生产和生活环境中的重要污染物之一,主要来源于煤炭、石油、木材等有机物的热解和不完全燃烧,以及烟草烟雾、烹调油烟等,可以通过空气、食物和饮用水等途径进入体内。苯并[a]芘的致癌性、免疫毒性、神经毒性等研究已有较多报道。苯并[a]芘对出生结局的影响虽然已得到毒理学、流行病学等研究的证实,但具体的生物学作用机制还有待进一步明确。近年来,基因芯片技术在环境污染物毒性机制研究方面有了一定的应用,如在苯并[a]芘致癌性机制研究方面,发现了一些具有协同作用的基因,如癌基因、抑癌基因、细胞周期相关基因、DNA合成、修复基因等。为探讨孕期苯并[a]芘暴露对子代的影响,本研究使用全基因表达谱芯片,以新生仔鼠肝细胞为毒作用的靶器官,了解孕期不同水平苯并[a]芘的暴露对仔鼠肝细胞中差异表达的基因谱,寻找在苯并[a]芘对子代毒性中其起重要作用的关键分子和信号通路,以进一步探讨苯并[a]芘导致对胎儿造成不良影响的可能机制。研究目的1、研究大鼠孕期B[a]P暴露对新生仔鼠生长发育的影响；2、以肝细胞为毒作用的靶器官,研究孕期不同苯并[a]芘水平暴露对仔鼠肝细胞基因表达水平的影响,寻找毒作用机制中具有核心调控作用的基因和信号通路；3、研究孕期不同剂量苯并[a]芘暴露对仔鼠肝脏凋亡相关蛋白Bcl-x1和Bax表达水平的影响。研究内容和方法1、将雌雄合笼后见阴栓的雌性SD大鼠确定为受孕,以检出日为孕期第0天。将孕鼠随机分为4组,每组8只,分为对照组(玉米油)和苯并[a]芘处理组(0.75mg/kg、1.5mg/kg和3mg/kg)。从妊娠第3天开始经胃灌注苯并[a]芘直到妊娠第17日结束,待自然分娩；2、从妊娠第3天开始经胃灌注苯并[a]芘直到妊娠第17日结束,分别在孕0、4、7、14、19天称孕鼠体重。待其自然分娩后24h内测量仔鼠的体重、身长及尾长；3、在分娩后24小时内取母鼠及仔鼠全血,使用高效液相色谱仪(荧光检测器)检测血清中苯并[a]芘的水平；4、取新生仔鼠肝脏,使用RatRef-12芯片检测各剂量组全基因组表达情况,筛选差异表达的基因(P<0.05,FDF<0.05)、进行差异基因显著性表达趋势分析、差异基因显著性信号通路分析、构建差异基因整体作用网络以及寻找核心基因的关键信号通路；5、采用实时定量PCR (Realtime PCR)方法对基因芯片筛选的核心基因表达水平进行验证；6、采用蛋白印迹(Western-blot)方法检测仔鼠肝脏中凋亡相关蛋白Bcl-xl和Bax的表达水平。研究结果1、建立的苯并[a]芘孕鼠染毒模型,结果显示随着孕期暴露水平的增加,新生仔鼠体重、身长、尾长等生长发育指标均有一定程度的下降,但未达到显著性差异(P>0.05)；2、在中剂量染毒组和高剂量染毒组母鼠血清中均检测到苯并[a]芘,浓度分别为0.563±0.037ng/ml和0.875±0.081ng/ml。与中剂量组相比,高剂量组的血清浓度显著升高(P<0.01)。在对照组和低剂量组中母鼠血清中均未检测到苯并[a]芘；在中剂量染毒组和高剂量染毒组仔鼠血清中均检测到苯并[a]芘,浓度分别为0.569±0.042ng/ml和0.881±0.089ng/ml。与中剂量组相比,高剂量组的血清浓度显著升高(P<0.01),在对照组和低剂量组仔鼠的血清中均未检测到苯并[a]芘；3、基因芯片结果显示,孕期苯并[a]芘暴露后,导致新生仔鼠肝脏有1235条基因发生明显变化；在26种剂量相关的基因变化趋势中,有6种与苯并[a]芘染毒剂量相关的具有显著性差异的表达趋势(P<0.05),差异表达的基因所涉及的信号通路共96条,其中有26条达到显著性水平(P<0.05),主要集中于：生长发育信号通路、毒物代谢信号通路和炎症信号通路方而。在差异基因构建的整体网络中Rela、Bcl211、Cyp2c13、Mapk8以及Plcg1为苯并[a]芘染毒导致的核心基因；4、Realtime PCR结果显示,在染毒组Cyp2c13基因表达水平显著升高,Gsto1、Rela、 Bcl211、Plcg1和Mapk8基因表达水平显著降低,与芯片结果相一致。5、Western-blot结果显示,与对照组相比,中、高剂量染毒组仔鼠肝脏的Bcl-xl蛋白表达均明显下降,Bax蛋白表达均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。研究结论1.孕期苯并[a]芘暴露对子代肝细胞基因表达产生了一定的影响,发现了一些具有代谢、凋亡和生长发育密切相关的核心调控作用的基因及相关信号通路,为探讨苯并[a]芘暴露对子代生长发育的影响及其毒作用机制提供了一定的依据。2.随着孕期苯并[a]芘染毒剂量的增加,新生仔鼠肝脏的凋亡相关蛋白Bcl-xl/Bax比值下降,提示细胞凋亡可能在苯并[a]芘对于子代的毒性作用中起到重要作用。