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蛋白激酶通过对蛋白底物丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化而完成对蛋白质的翻译后修饰,这一过程在许多细胞活动中起着十分重要的作用,包括:细胞外信号传导、细胞内运输、细胞周期进程以及精子发生等。
睾丸特异性蛋白激酶(Testis-specific serine/threonine kinase,TSSK)是首先在哺乳动物中被发现的,它是一个大家族,该家族有6个成员,是一类专一的在精子发生过程中起到重要作用的蛋白激酶。实验证明这类酶和睾丸组织的精子形成和分化有关。通过表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)方法,用人的TSSK2、TSSK4、TSSK6和小鼠(Mus musculus)的TSSKI、TSSK3、TSSK5的cDNA为探针在家蚕(Bombyx mori)GenBank EST数据库中发现同源基因。通过在家蚕基因组数据库的同源性检索,并进行电子克隆,获得一条家蚕精巢特异性蛋白激酶基因的序列,据此预测序列设计引物,成功地在家蚕精巢组织中克隆了该基因完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),命名为Bm-TSSK(GenBank登录号:JN159476)。序列分析及同源性比对表明:该基因序列长1402 bp,ORF为1041bp,推测编码346个氨基酸残基;该基因推导的氨基酸序列在进化关系上与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、雄蜂(Bombus impatiens)、顶切叶蚁(Acromyrmexechinatior)的亲缘关系较近,相似性分别为81%、86%和85%。
基于定量PCR和基因芯片的数据分析显示Bm-TSSK在家蚕5龄第3天幼虫的精巢特异性高表达,并对家蚕4龄时期,5龄时期和上蔟到蛹期各天数精巢组织做了表达谱分析。结果显示,家蚕基因Bm-TSSK在4龄眠期的转录水平最高。由于该时期是家蚕精母细胞开始分化的高峰期,推测Bm-TSSK可能通过影响精母细胞的分化过程参与家蚕精子的形成。该基因在上蔟到蛹期阶段的转录水平平稳。
本文通过采用RNAi的方法,抑制Bm-TSSK,运用适时荧光定量PCR检测经RNAi后Bm-TSSK的转录表达水平。结果显示,该基因在幼虫和蛹期的抑制效果较好,分别为对照的58%和27%。对蛹抑制对象进行杂交,调查了受精率和F1代蚁蚕的孵化率。结果显示,F1代的受精率分别为97%和95%,实验组蚕卵的孵化率与对照组比较降低,分别为68%、95%。研究结果表明,家蚕Bm-TSSK基因的表达下调,对精子的受精率无显著影响,但影响孵化率,该基因对家蚕生殖的作用机制还有待进一步深入研究。