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【研究背景】
皮肤是人体最大的器官，对外界病原体变应原和物理损伤提供了保护性屏障，而且具有免疫监视、感觉器官的作用。细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)是表皮和真皮的重要组成部分，对维持正常的生理结构至关重要。越来越多的证据表明，ECM作为正常稳态过程的一部分，ECM的重塑始终参与机械刺激、血管生成和伤口愈合的过程中。此外，ECM与其他ECM组织、免疫细胞和血管细胞相互作用，调节细胞增殖、分化和细胞内信号传导。由于ECM的重塑受到严格调控，即使是微小的改变也可能扰乱其平衡，引发疾病的发生。完整的皮肤屏障功能包括角质层结构完整、表皮足够涵养水份的能力、以及抵抗外界刺激的能力，表皮水合作用的失衡将导致角质层分化异常、结构缺陷和屏障功能下降，临床出现干燥、瘙痒和皮肤敏感。
水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是水、甘油和其他小溶质通过细胞膜的选择性通道，在上皮细胞和内皮细胞中表达。到目前为止，在哺乳动物细胞中已检测出至少13种亚型，即AQP0-AQP12，可分为AQP和Aquaglyceroporins两类，AQP包括大多数成员，包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6和AQP8，仅渗透水；而Aquaglyceroporins包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10，转运水以及小溶质，如甘油、尿素和过氧化氢。Caspase-14是角质形成细胞(Kerotinocyte， KC)激活角化过程中的一种蛋白酶，一方面在KC的角化和角质层的形成起重要作用；另一方面，Caspase-14可以直接裂解Pro-FLG，将FLG降解为天然保湿因子(Natural moisturizing factors，NMFs),对维持角质层的含水量和屏障功能起重要作用。KC内部主要由中间丝聚合蛋白(Filaggrin，FLG)聚集而成，FLG与其他几种蛋白一起交联成一个机械坚固的角化包膜，为细胞外脂质基质提供支架。FLG可能通过多种机制影响皮肤屏障，一方面作为角质化细胞被膜的组分和纤维聚集蛋白，FLG对于角质层的结构和机械完整性非常重要；另一方面FLG降解产物参与维持皮肤的水合作用和酸性环境，这两者对参与皮肤炎症、脂质合成和角化过程的酶活性有重要影响。骨膜素蛋白(Periostin，Per)是一种ECM蛋白，与Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白直接相连，参与ECM网状结构的形成。此外，由于Per是一种细胞基质蛋白，作为整合素受体的配体直接作用于各种细胞，诱导细胞增殖、迁移和分化的信号传导，现研究认为，Per与皮肤老化、伤口愈合和特应性皮炎的炎症过程有关。基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)又称明胶酶B，可由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞以及KC表达，可分解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原,还可分解弹性纤维，破坏基底膜的完整性，从而促使组织发生炎症、延迟愈合等改变，同时，MMP-9也是调节细胞生长、迁移、浸润、炎症及血管生成的关键信号之一。透明质酸(Hyaluronan，HA)是皮肤ECM中含量丰富的成分，皮肤中的HA达到机体总量的50％甚至更高。HA具有吸水及锁水、润滑、调节渗透压等作用，在细胞增生和分化、组织重塑、血管形成、创伤愈合、肿瘤生长及转移、预防光老化、保护正常细胞免受毒性细胞及自由基等的侵袭中发挥着重要的生物学意义，在维持KC、表皮和真皮结构弹性和水结合力的功能中发挥重要作用。
外用糖皮质激素(Topical glucocorticoids，TGCs)因其抗炎、抗增殖作用，是皮肤科中重要的治疗手段。长期TGCs可出现一系列皮肤屏障破坏的问题，表现为皮肤变薄，弹性下降、血管扩张、紫癜、毳毛增多和痤疮样皮损，伴有不同程度的瘙痒、灼热等自觉症状。激素依赖性皮炎，是指由于外用含糖皮质激素制剂后原有皮肤病皮损和症状显著好转，一旦停药导致原有症状、体征复发、甚至加重，迫使患者再次外用糖皮质激素的一种亚急性炎症性皮肤病。我们认为，激素依赖性皮炎与长期超剂量、或超浓度、或超范围外用糖皮质激素制剂有关。糖皮质激素对伴有表皮屏障功能异常的炎症性皮肤病可改善其屏障功能，早期可因其抗炎作用修复皮肤屏障，长期使用可通过破坏KC及其结构蛋白、角质层脂质等影响皮肤屏障功能。
桉树脑(Eucalyptol)，又名1,8-桉叶素(1,8-cineole，Cin)是一种单萜类化合物，在桉树叶、巴豆、紫花苜蓿、山香属、蔷薇属、鼠尾草属等芳香植物中天然存在。桉树脑已被广泛用于治疗呼吸道疾病，包括支气管炎、鼻窦炎、支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病。在体外实验研究表明，可以作为抑菌剂有效抑制呼吸系统病原体，其中在非洲和其他大陆传统医学中，桉叶油的芳香疗法可治疗肺结核。桉树脑还可治疗其他疾病如胃炎、胰腺炎、结肠损伤、糖尿病、神经退行性疾病阿尔茨海默病和全膝关节置换引起的疼痛，可舒张气管、血管平滑肌和心肌作用，可通过影响细胞膜电位、降低神经细胞兴奋性发挥抗焦虑作用。此外，桉树脑通过炎症过程和抗氧化应激促进肿瘤的转化，可能是一种潜在的抗肿瘤药物。有较多的体内外研究表明：桉树脑有抗微生物、抗炎、抗氧化、保湿、抗肿瘤、抗组胺、促进伤口愈合、促渗透、抗焦虑等作用，但在皮肤科的应用较少，其强大的生物活性可能对皮肤屏障有修复作用。因此,为探讨桉树脑对皮肤屏障的作用和相关机制，我们选用倍他米松(Betamethasone，BT)为对照，通过qRT-PCR、Westernblot和ELISA方法检测HaCaT细胞AQP3、Caspase-14、FLG、Per、MMP-9、HA基因转录及其蛋白的表达。
【目的】
本研究以体外培养的永生化角质形成细胞(HaCaT)为研究对象，选用强效激素倍他米松(Betamethasone，BT)作为对照，桉树脑作为干预措施，通过qRT-PCR、Westernblot和ELISA方法，以桉树脑、倍他米松不同干预条件下HaCaT细胞AQP3、Caspase-14、FLG、Per、MMP-9、HA基因mRNA转录及其蛋白的表达作为指标，探讨桉树脑、BT作用下HaCaT细胞合成皮肤屏障相关ECM的影响，为研制桉树脑联合激素的复方制剂减少激素依赖性皮炎的可行性提供理论依据。
【方法】
1、细胞培养：复苏的HaCaT细胞传至第3代用于实验。
2、选择处理HaCaT的最佳桉树脑、倍他米松药物浓度和处理时间：用0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%(v/v)桉树脑，0.01μM、0.1μM、1μM、10μM倍他米松和0.1%DMSO孵育HaCaT细胞12h、24h、36h，CCK-8法检测HaCaT细胞的增殖活性，选取相比于正常对照组细胞活性无影响的浓度；选取0.01%、0.001%桉树脑和、1μM、10μM倍他米松混合孵育HaCaT细胞12h、24h、36h，CCK-8法检测HaCaT细胞的增殖活性，选出混合后最适的浓度和时间进行下一步实验。
3、分组：①0.01%桉树脑；②0.001%桉树脑；③10μM倍他米松；④0.01%桉树脑+10μM倍他米松；⑤0.001%桉树脑+10μM倍他米松；⑥正常对照组。
4、检测方法及指标：按分组的处理因素孵育HaCaT细胞36h，采用qRT-PCR、Westernblot检测各分组AQP3、Caspase-14、FLG、Per、MMP-9的mRNA转录及其蛋白的表达，ELISA检测各分组细胞上清的HA变化。
【结果】
1、不同浓度的桉树脑和倍他米松单独对HaCaT细胞增殖活性的影响：
研究显示：与正常对照组比较，在12、24、36h，0.1%DMSO组HaCa对T细胞活性无明显差异(P＜0.05)，说明0.1%DMSO对细胞活性无影响。在0.01%～0.00001%(v/v)浓度范围内桉树脑处理12h、24h、36h不同时间对于细胞增殖活性有差异(F=360.1，P＜0.05)，桉树脑的作用浓度和时间对HaCaT细胞的生长有交互作用(F=51.72，P＜0.05)。在0.01μM～10μM浓度范围内，倍他米松处理不同时间对于细胞增殖活性均无差异(F=1.27，P＞0.05)，倍他米松的作用浓度和时间对HaCaT细胞的生长无交互作用(F=0.55，P＞0.05)。与正常对照组相比，0.00001%-0.01%桉树脑孵育HaCaT细胞12h明显提高细胞活性(均P＜0.05)。0.01%、0.001%桉树脑孵育HaCaT细胞24h，同样明显提高细胞活性(均P＜0.05)。类似的，与正常对照组相比，0.1μM和0.01μM倍他米松孵育HaCaT细胞24h可明显提高细胞活性(均P＜0.05)。选择0.001%、0.01%桉树脑和1μM、10μM倍他米松进行下一步实验。
2、不同浓度的桉树脑和倍他米松混合对HaCaT细胞增殖活性的影响：
研究显示：与正常对照组相比，除了0.01%Cin+1μMBT组孵育HaCaT细胞36h明显抑制细胞活性外(P＜0.05)，桉树脑+倍他米松联合处理不同时间(12 h、24 h、36 h)对于细胞增殖活性无差异(F=0.009，P＞0.05)，桉树脑+倍他米松联合作用浓度和时间未显示对HaCaT细胞生长有交互作用(F=0.22，P＞0.05)。因此选择0.01%Cin+10μMBT组和0.001%Cin+10μMBT组，以及最适孵育浓度36h进行后续实验。
3、不同分组对AQP3mRNA和蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，0.01%、0.001%桉树脑可显著增加AQP3mRNA的转录和蛋白的表达(分别均P＜0.05)，且0.01%桉树脑的促转录和促表达效应比0.001%桉树脑强(均P＜0.05)，即与浓度呈正相关；但与正常对照组相比，10μM倍他米松明显下调AQP3mRNA转录及其蛋白表达(均P＜0.05)；而与10μM倍他米松单独孵育相比，0.01%、0.001%桉树脑分别联合10μM倍他米松共同孵育HaCaT后，虽然均可以增加AQP3mRNA的转录和AQP3蛋白表达(均P＜0.05)，但AQP3蛋白表达水平低于正常对照组(均P＜0.05)。
4、不同分组对Caspase-14mRNA和蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，0.01%桉树脑组显著上调Caspase-14mRNA的转录，10μM倍他米松组下调Caspase-14mRNA的转录，具有统计学意义(均P＜0.05)。而与10μM倍他米松组相比，0.01%桉树脑组+10μM倍他米松组也显著上调Caspase-14mRNA的转录，且具有统计学意义(均P＜0.05)。但各组Caspase-14蛋白表达无明显的统计学差异(P>0.05)。
5、不同分组对Pro-FLGmRNA和FLG蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，0.01%桉树脑组、0.001%桉树脑组、10μM倍他米松组、0.01%桉树脑组+10μM倍他米松组和0.001%桉树脑组+10μM倍他米松组(均P＜0.05)均能显著下调Pro-FLGmRNA的转录，且差异具有统计学意义，而有趣的是，与正常对照组，研究显示：与正常对照组相比，10μM倍他米松组上调FLG蛋白，具有统计学意义(均P＜0.05)。相比于倍他米松单独处理组，0.01%桉树脑组、0.001%桉树脑混合10μM倍他米松后下调FLG蛋白表达，差异具有统计学意义(均P＜0.05)。(均P＜0.05)。
6、不同分组对PermRNA和蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，除了0.001%桉树脑组，其余组别均明显下调PermRNA的转录，且差异具有统计学意义(均P＜0.05)；但所有组别均下调Per蛋白的表达，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。
7、不同分组对MMP-9mRNA和蛋白的影响
研究显示：与正常对照组相比，各组均能显著下调MMP-9mRNA基因的转录(均P＜0.05)，且具有统计学意义。而与10μM倍他米松组相比，0.01%、0.001%桉树脑分别联合10μM倍他米松组显著下调MMP-9mRNA的转录效果更明显(均P＜0.05)，差异具有统计学意义。而在翻译水平显示，相比于正常对照组，0.01%桉树脑组和10μM倍他米松组明显下调MMP-9蛋白的表达(均P＜0.05)，而0.001%桉树脑组和联合10μM倍他米松后对MMP-9蛋白的表达无影响(P＞0.05)。
8、不同分组对细胞上清HA蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，10μM倍他米松下调HA水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)。10μM倍他米松+0.01%桉树脑组和10μM倍他米松+0.001%桉树脑组可逆转单独10μMBT组对HA的作用，上调HA水平(均P＜0.05)，但不能达到正常对照组的水平(均P＜0.05)。
【结论】
1、倍他米松可下调HaCaT细胞中AQP3、Per、MMP-9mRNA和蛋白、HA、Caspase-14mRNA、Pro-FLGmRNA的表达，上调FLG蛋白的表达；
2、桉树脑可上调HaCaT细胞中AQP3mRNA和蛋白的表达以及Caspase-14mRNA，下调Pro-FLGmRNA以及Per、MMP-9mRNA和蛋白的表达；
3、桉树脑可部分或者完全逆转倍他米松下调HaCaT细胞中AQP3mRNA和蛋白、Caspase-14mRNA、HA的作用；
4、桉树脑可以通过调节部分细胞外基质蛋白基因mRNA转录和蛋白表达水平参与屏障保护作用，联合糖皮质激素制成复方制剂应用于临床，并有可能减轻不适当的使用激素制剂导致的皮肤屏障的损伤。
皮肤是人体最大的器官，对外界病原体变应原和物理损伤提供了保护性屏障，而且具有免疫监视、感觉器官的作用。细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)是表皮和真皮的重要组成部分，对维持正常的生理结构至关重要。越来越多的证据表明，ECM作为正常稳态过程的一部分，ECM的重塑始终参与机械刺激、血管生成和伤口愈合的过程中。此外，ECM与其他ECM组织、免疫细胞和血管细胞相互作用，调节细胞增殖、分化和细胞内信号传导。由于ECM的重塑受到严格调控，即使是微小的改变也可能扰乱其平衡，引发疾病的发生。完整的皮肤屏障功能包括角质层结构完整、表皮足够涵养水份的能力、以及抵抗外界刺激的能力，表皮水合作用的失衡将导致角质层分化异常、结构缺陷和屏障功能下降，临床出现干燥、瘙痒和皮肤敏感。
水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是水、甘油和其他小溶质通过细胞膜的选择性通道，在上皮细胞和内皮细胞中表达。到目前为止，在哺乳动物细胞中已检测出至少13种亚型，即AQP0-AQP12，可分为AQP和Aquaglyceroporins两类，AQP包括大多数成员，包括AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6和AQP8，仅渗透水；而Aquaglyceroporins包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10，转运水以及小溶质，如甘油、尿素和过氧化氢。Caspase-14是角质形成细胞(Kerotinocyte， KC)激活角化过程中的一种蛋白酶，一方面在KC的角化和角质层的形成起重要作用；另一方面，Caspase-14可以直接裂解Pro-FLG，将FLG降解为天然保湿因子(Natural moisturizing factors，NMFs),对维持角质层的含水量和屏障功能起重要作用。KC内部主要由中间丝聚合蛋白(Filaggrin，FLG)聚集而成，FLG与其他几种蛋白一起交联成一个机械坚固的角化包膜，为细胞外脂质基质提供支架。FLG可能通过多种机制影响皮肤屏障，一方面作为角质化细胞被膜的组分和纤维聚集蛋白，FLG对于角质层的结构和机械完整性非常重要；另一方面FLG降解产物参与维持皮肤的水合作用和酸性环境，这两者对参与皮肤炎症、脂质合成和角化过程的酶活性有重要影响。骨膜素蛋白(Periostin，Per)是一种ECM蛋白，与Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白直接相连，参与ECM网状结构的形成。此外，由于Per是一种细胞基质蛋白，作为整合素受体的配体直接作用于各种细胞，诱导细胞增殖、迁移和分化的信号传导，现研究认为，Per与皮肤老化、伤口愈合和特应性皮炎的炎症过程有关。基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)又称明胶酶B，可由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞以及KC表达，可分解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原,还可分解弹性纤维，破坏基底膜的完整性，从而促使组织发生炎症、延迟愈合等改变，同时，MMP-9也是调节细胞生长、迁移、浸润、炎症及血管生成的关键信号之一。透明质酸(Hyaluronan，HA)是皮肤ECM中含量丰富的成分，皮肤中的HA达到机体总量的50％甚至更高。HA具有吸水及锁水、润滑、调节渗透压等作用，在细胞增生和分化、组织重塑、血管形成、创伤愈合、肿瘤生长及转移、预防光老化、保护正常细胞免受毒性细胞及自由基等的侵袭中发挥着重要的生物学意义，在维持KC、表皮和真皮结构弹性和水结合力的功能中发挥重要作用。
外用糖皮质激素(Topical glucocorticoids，TGCs)因其抗炎、抗增殖作用，是皮肤科中重要的治疗手段。长期TGCs可出现一系列皮肤屏障破坏的问题，表现为皮肤变薄，弹性下降、血管扩张、紫癜、毳毛增多和痤疮样皮损，伴有不同程度的瘙痒、灼热等自觉症状。激素依赖性皮炎，是指由于外用含糖皮质激素制剂后原有皮肤病皮损和症状显著好转，一旦停药导致原有症状、体征复发、甚至加重，迫使患者再次外用糖皮质激素的一种亚急性炎症性皮肤病。我们认为，激素依赖性皮炎与长期超剂量、或超浓度、或超范围外用糖皮质激素制剂有关。糖皮质激素对伴有表皮屏障功能异常的炎症性皮肤病可改善其屏障功能，早期可因其抗炎作用修复皮肤屏障，长期使用可通过破坏KC及其结构蛋白、角质层脂质等影响皮肤屏障功能。
桉树脑(Eucalyptol)，又名1,8-桉叶素(1,8-cineole，Cin)是一种单萜类化合物，在桉树叶、巴豆、紫花苜蓿、山香属、蔷薇属、鼠尾草属等芳香植物中天然存在。桉树脑已被广泛用于治疗呼吸道疾病，包括支气管炎、鼻窦炎、支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病。在体外实验研究表明，可以作为抑菌剂有效抑制呼吸系统病原体，其中在非洲和其他大陆传统医学中，桉叶油的芳香疗法可治疗肺结核。桉树脑还可治疗其他疾病如胃炎、胰腺炎、结肠损伤、糖尿病、神经退行性疾病阿尔茨海默病和全膝关节置换引起的疼痛，可舒张气管、血管平滑肌和心肌作用，可通过影响细胞膜电位、降低神经细胞兴奋性发挥抗焦虑作用。此外，桉树脑通过炎症过程和抗氧化应激促进肿瘤的转化，可能是一种潜在的抗肿瘤药物。有较多的体内外研究表明：桉树脑有抗微生物、抗炎、抗氧化、保湿、抗肿瘤、抗组胺、促进伤口愈合、促渗透、抗焦虑等作用，但在皮肤科的应用较少，其强大的生物活性可能对皮肤屏障有修复作用。因此,为探讨桉树脑对皮肤屏障的作用和相关机制，我们选用倍他米松(Betamethasone，BT)为对照，通过qRT-PCR、Westernblot和ELISA方法检测HaCaT细胞AQP3、Caspase-14、FLG、Per、MMP-9、HA基因转录及其蛋白的表达。
【目的】
本研究以体外培养的永生化角质形成细胞(HaCaT)为研究对象，选用强效激素倍他米松(Betamethasone，BT)作为对照，桉树脑作为干预措施，通过qRT-PCR、Westernblot和ELISA方法，以桉树脑、倍他米松不同干预条件下HaCaT细胞AQP3、Caspase-14、FLG、Per、MMP-9、HA基因mRNA转录及其蛋白的表达作为指标，探讨桉树脑、BT作用下HaCaT细胞合成皮肤屏障相关ECM的影响，为研制桉树脑联合激素的复方制剂减少激素依赖性皮炎的可行性提供理论依据。
【方法】
1、细胞培养：复苏的HaCaT细胞传至第3代用于实验。
2、选择处理HaCaT的最佳桉树脑、倍他米松药物浓度和处理时间：用0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%(v/v)桉树脑，0.01μM、0.1μM、1μM、10μM倍他米松和0.1%DMSO孵育HaCaT细胞12h、24h、36h，CCK-8法检测HaCaT细胞的增殖活性，选取相比于正常对照组细胞活性无影响的浓度；选取0.01%、0.001%桉树脑和、1μM、10μM倍他米松混合孵育HaCaT细胞12h、24h、36h，CCK-8法检测HaCaT细胞的增殖活性，选出混合后最适的浓度和时间进行下一步实验。
3、分组：①0.01%桉树脑；②0.001%桉树脑；③10μM倍他米松；④0.01%桉树脑+10μM倍他米松；⑤0.001%桉树脑+10μM倍他米松；⑥正常对照组。
4、检测方法及指标：按分组的处理因素孵育HaCaT细胞36h，采用qRT-PCR、Westernblot检测各分组AQP3、Caspase-14、FLG、Per、MMP-9的mRNA转录及其蛋白的表达，ELISA检测各分组细胞上清的HA变化。
【结果】
1、不同浓度的桉树脑和倍他米松单独对HaCaT细胞增殖活性的影响：
研究显示：与正常对照组比较，在12、24、36h，0.1%DMSO组HaCa对T细胞活性无明显差异(P＜0.05)，说明0.1%DMSO对细胞活性无影响。在0.01%～0.00001%(v/v)浓度范围内桉树脑处理12h、24h、36h不同时间对于细胞增殖活性有差异(F=360.1，P＜0.05)，桉树脑的作用浓度和时间对HaCaT细胞的生长有交互作用(F=51.72，P＜0.05)。在0.01μM～10μM浓度范围内，倍他米松处理不同时间对于细胞增殖活性均无差异(F=1.27，P＞0.05)，倍他米松的作用浓度和时间对HaCaT细胞的生长无交互作用(F=0.55，P＞0.05)。与正常对照组相比，0.00001%-0.01%桉树脑孵育HaCaT细胞12h明显提高细胞活性(均P＜0.05)。0.01%、0.001%桉树脑孵育HaCaT细胞24h，同样明显提高细胞活性(均P＜0.05)。类似的，与正常对照组相比，0.1μM和0.01μM倍他米松孵育HaCaT细胞24h可明显提高细胞活性(均P＜0.05)。选择0.001%、0.01%桉树脑和1μM、10μM倍他米松进行下一步实验。
2、不同浓度的桉树脑和倍他米松混合对HaCaT细胞增殖活性的影响：
研究显示：与正常对照组相比，除了0.01%Cin+1μMBT组孵育HaCaT细胞36h明显抑制细胞活性外(P＜0.05)，桉树脑+倍他米松联合处理不同时间(12 h、24 h、36 h)对于细胞增殖活性无差异(F=0.009，P＞0.05)，桉树脑+倍他米松联合作用浓度和时间未显示对HaCaT细胞生长有交互作用(F=0.22，P＞0.05)。因此选择0.01%Cin+10μMBT组和0.001%Cin+10μMBT组，以及最适孵育浓度36h进行后续实验。
3、不同分组对AQP3mRNA和蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，0.01%、0.001%桉树脑可显著增加AQP3mRNA的转录和蛋白的表达(分别均P＜0.05)，且0.01%桉树脑的促转录和促表达效应比0.001%桉树脑强(均P＜0.05)，即与浓度呈正相关；但与正常对照组相比，10μM倍他米松明显下调AQP3mRNA转录及其蛋白表达(均P＜0.05)；而与10μM倍他米松单独孵育相比，0.01%、0.001%桉树脑分别联合10μM倍他米松共同孵育HaCaT后，虽然均可以增加AQP3mRNA的转录和AQP3蛋白表达(均P＜0.05)，但AQP3蛋白表达水平低于正常对照组(均P＜0.05)。
4、不同分组对Caspase-14mRNA和蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，0.01%桉树脑组显著上调Caspase-14mRNA的转录，10μM倍他米松组下调Caspase-14mRNA的转录，具有统计学意义(均P＜0.05)。而与10μM倍他米松组相比，0.01%桉树脑组+10μM倍他米松组也显著上调Caspase-14mRNA的转录，且具有统计学意义(均P＜0.05)。但各组Caspase-14蛋白表达无明显的统计学差异(P>0.05)。
5、不同分组对Pro-FLGmRNA和FLG蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，0.01%桉树脑组、0.001%桉树脑组、10μM倍他米松组、0.01%桉树脑组+10μM倍他米松组和0.001%桉树脑组+10μM倍他米松组(均P＜0.05)均能显著下调Pro-FLGmRNA的转录，且差异具有统计学意义，而有趣的是，与正常对照组，研究显示：与正常对照组相比，10μM倍他米松组上调FLG蛋白，具有统计学意义(均P＜0.05)。相比于倍他米松单独处理组，0.01%桉树脑组、0.001%桉树脑混合10μM倍他米松后下调FLG蛋白表达，差异具有统计学意义(均P＜0.05)。(均P＜0.05)。
6、不同分组对PermRNA和蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，除了0.001%桉树脑组，其余组别均明显下调PermRNA的转录，且差异具有统计学意义(均P＜0.05)；但所有组别均下调Per蛋白的表达，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。
7、不同分组对MMP-9mRNA和蛋白的影响
研究显示：与正常对照组相比，各组均能显著下调MMP-9mRNA基因的转录(均P＜0.05)，且具有统计学意义。而与10μM倍他米松组相比，0.01%、0.001%桉树脑分别联合10μM倍他米松组显著下调MMP-9mRNA的转录效果更明显(均P＜0.05)，差异具有统计学意义。而在翻译水平显示，相比于正常对照组，0.01%桉树脑组和10μM倍他米松组明显下调MMP-9蛋白的表达(均P＜0.05)，而0.001%桉树脑组和联合10μM倍他米松后对MMP-9蛋白的表达无影响(P＞0.05)。
8、不同分组对细胞上清HA蛋白的影响：
研究显示：与正常对照组相比，10μM倍他米松下调HA水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)。10μM倍他米松+0.01%桉树脑组和10μM倍他米松+0.001%桉树脑组可逆转单独10μMBT组对HA的作用，上调HA水平(均P＜0.05)，但不能达到正常对照组的水平(均P＜0.05)。
【结论】
1、倍他米松可下调HaCaT细胞中AQP3、Per、MMP-9mRNA和蛋白、HA、Caspase-14mRNA、Pro-FLGmRNA的表达，上调FLG蛋白的表达；
2、桉树脑可上调HaCaT细胞中AQP3mRNA和蛋白的表达以及Caspase-14mRNA，下调Pro-FLGmRNA以及Per、MMP-9mRNA和蛋白的表达；
3、桉树脑可部分或者完全逆转倍他米松下调HaCaT细胞中AQP3mRNA和蛋白、Caspase-14mRNA、HA的作用；
4、桉树脑可以通过调节部分细胞外基质蛋白基因mRNA转录和蛋白表达水平参与屏障保护作用，联合糖皮质激素制成复方制剂应用于临床，并有可能减轻不适当的使用激素制剂导致的皮肤屏障的损伤。