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背景慢性肝病是影响着人类健康的主要问题。其共同进展主要包括慢性肝炎、肝纤维化和肝硬化。对慢性肝病而言,过度的慢性应激会导致肝细胞的衰老,进一步加重肝病的进展。因而,探索在慢性肝病的基础上损伤诱导,肝细胞衰老加重的情况,并寻找其有效的防治方案,一直是国内外探讨要点和难点。肝纤维化的发生和发展过程主要是持续的刺激因素作用于肝细胞,启动肝细胞炎症反应并分泌多种炎症细胞因子,后者激活效应细胞(如肝星状细胞HSC、肝窦内皮细胞、Kupffer细胞)、细胞外基质形成和沉积,以致纤维化形成。其中肝细胞是病毒、酒精、脂肪、自身免疫等刺激因素的靶细胞,肝脏炎症的启动来源于肝细胞受损和衰老。肝细胞衰老是肝细胞持续损伤后的一种转归,是肝纤维化慢性进展的根源。目的本文通过CCl4诱导大鼠建立肝纤维化模型,建模成功后,给予大鼠持续的慢性应激,通过观察肝组织中p21、SABG及IGF-1、GH-R这些检测指标来评价在肝纤维化的基础上给予持续的慢性应激,肝细胞的衰老情况,为以后寻找逆转肝细胞衰老的办法提供依据。材料与方法1.CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型的建立:选取正常SD雄性大鼠(n=80)只,体重200g~250g,分为正常对照组(n=20)只和肝纤维化模型组(n=60)只,肝纤维化模型组按照3ml/kg给予大鼠40%CCl4皮下注射,2times/w,第一剂加倍,共8w。正常对照组,剂量、时间、部位同上,皮下注射橄榄油溶液。除此之外,饮食喂养均一致。2.对肝纤维化大鼠进行慢性应激干预:采用慢性不可预知的应激方法,随机设计10种不可预知的刺激因素刺激大鼠:(1)禁食24h。(2)禁水24h。(3)热刺激:用小型水杯装100°C的开水,拧紧瓶盖,放入鼠笼,自然冷却。(4)冷刺激:用塑料瓶盛水冰冻完全后放入鼠笼,待其自然解冻。(5)倾斜饲养:将鼠笼一边抬高35°以上,维持24h。(6)陌生环境:将大鼠从鼠笼里移至大玻璃钢里24h。(7)陌生气味:用玻璃杯盛装5ml的冰醋酸放于鼠笼旁边24h。(8)行为束缚2h:用细捆绑住大鼠双下肢2h。(9)电击:电流0.1m A,4times/min,连续刺激10min。(10)昼夜交替:白天用不透光的暗布罩住鼠笼模拟黑夜,天黑后用灯光照射鼠笼模拟白天。每日从10种刺激方法中随机抽签选取1种,隔天不重复,每早8点更换刺激,共4周。将已经成功构建的肝纤维化大鼠编号随机抽取分为2组,肝纤维化+慢性应激干预组(n=30):在肝纤维化模型建立成功后随即给予慢性应激干预4周。肝纤维化+慢性应激干预对照组(n=20):在肝纤维化模型建立成功后不给予慢性刺激,共4周,同时CCl4诱导的肝纤维化实验组中正常对照组处死部分后留取剩余大鼠作为此次研究的空白对照组(n=15),停止注射橄榄油溶液,不给于任何刺激,饮食喂养方法均统一。观察并记录每组大鼠每日的基本情况(体重、饮食、睡眠等)。3.标本采集与检测:在CCl4诱导大鼠8周后处死两组部分大鼠,切取肝脏,对肝脏病理组织进行HE染色和Masson染色并观察模型建造成功与否。在慢性应激开始的0周、2周末、4周末分批处死三组部分大鼠,留取肝右叶组织检测p21、SABG、IGF-1、GH-R等指标,评估肝细胞衰老的情况,并对肝脏病理组织行HE染色和Masson染色,观察给予慢性应激干预后肝纤维化是否加重。结果1.给予大鼠40%CCl4溶液,3ml/Kg皮下注射,2times/w,第一剂加倍,材料与方法共8周,肝纤维化模型可建立成功。2.慢性应激干预4周后,慢性应激干预组大鼠体重(391.16±12.36)g与干预对照组大鼠体重(443.22±12.0)g及空白对照组大鼠体重(569.94±9.20)g相比,较慢性应激干预对照组及空白对照组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.慢性应激干预4周后,慢性应激干预组与干预对照组相比,肝组织病理表现显示肝纤维化程度进一步加重。采用肝纤维化半定量评分系统进行表示,慢性应激干预组半定量评分结果示(14.25±1.49)明显高于干预对照组(7.60±1.14),差异具有统计学意义(P<0.05)。4.慢性应激干预4周后,肝组织中p21水平应激干预组(23.57±3.24)%明显高于干预对照组(14.98±1.64)%及空白对照组(7.78±0.73)%。肝组织中SABG水平应激干预组(24.60±1.33)%明显高于干预对照组(15.21±0.96)%及空白对照组(7.42±0.89)%,两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。肝组织中IGF-1应激干预组免疫荧光结果回示:+,荧光强度明显弱于干预对照组:++,及空白对照组+++。肝组织中GH-R应激干预组免疫荧光结果回示:+,荧光强度明显弱于干预对照组:++,及空白对照组+++。结论1.给予肝纤维化大鼠慢性应激干预,大鼠营养不良状况进一步加重。2.慢性应激干预,可使大鼠肝脏的纤维化程度加重。3.慢性应激干预,大鼠肝组织中衰老相关标记物p21、SABG水平明显升高,提示慢性应激干预可促进大鼠肝细胞衰老。4.慢性应激干预,可使肝细胞中IGF-1,GH-R含量下降,提示慢性应激干预可加重肝细胞损伤,加重肝纤维化程度。