第一部分 神经干细胞体外分离培养、诱导分化及鉴定实验背景及目的:海马区神经发生减少被认为是放射性认知功能障碍发生机制中最重要的研究内容,近年来有研究认为神经干细胞(neural stem cell,NSCs)移植有望成为改善放射性认知功能障碍最有效的方法。神经干细胞能够自我更新,多向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。因此研究关键在于体外分离培养具有该能力的细胞。方法:课题组前期已经从孕龄14-16天的Sprague Dawley(SD)大鼠的胎鼠脑中分离出了神经干细胞,本研究除了体外扩增外,需进行诱导分化,并使用免疫荧光染色技术分别鉴定神经十细胞特异性标基物神经巢蛋白(Nestin),诱导分化后神经元标志物β Ⅲ微管蛋白(Tuj1)和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果:悬浮状态生长的神经球表达标志物Nestin蛋白,在含血清条件下可以贴壁生长并分化,具有神经细胞形态,并表达标志物Tuj1蛋自和GFAP蛋自。结论:在体外培养条件下,本课题组分离培养出的神经干细胞具有自我分裂、扩增及多向分化的能力,为下一步实验做准备。第二部分过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区BDNF下游受体表达的影响实验背景及目的:脑源性神经营养因子(BDNF)主要通过结合下游受体发挥神经保护作用,课题组前期已经发现过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后BDNF表达升高,本实验主要观察BDNF下游受体酪氨酸激酶受体B(TrkB)、P75神经营养因子受体(P75NTR)的表达情况。方法:大鼠全脑给予单次20Gy照射。取40只1月龄SD大鼠,按随机数字表法分为四组:空白对照组(C组)、20Gy照射组(R组)、20Gy照射后GFP修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-NSCs组)和20Gy照射后GFP-BDNF修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-BDNF-NSCs组)。照后4周移植神经干细胞,分别于移植后2周、8周、14周,采用PCR及Western Blot法检测BDNF、TrkB、P75NTR的含量及表达水平。结果:在移植后2周、8周、14周,与R组相比,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内BDNF蛋白表达水平明显升高;在移植后2周、8周、14周,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内TrkB mRNA表达水平及蛋白表达水平明显升高;在移植后2周,与R组相比,R+GFP-BDNF-NSCs组P75NTR mRNA水平及蛋白表达水平下降,其余时间点未见明显改变。结论:过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后,可以促进海马区BDNF下游受体TrkB的表达,对P75NTR的表达影响不大。第三部分过表达BDNF的神经干细胞移植对受照大鼠海马区突触形成的影响实验背景及目的:BDNF可通过突触前、突触后的作用机制影响突触形成的数目、功能及神经元轴突树突形态。突触形成是神经环路建立的基础,神经环路的建立作为放射性认知功能障碍改善的亚细胞水平的依据。本实验探讨过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后是否对突触形成产生影响。方法:给予大鼠全脑单次20Gy照射。本实验部分取40只一月龄SD大鼠,随机分为四组:空白对照组(C组)、20Gy照射组(R组)、20Gy照射后GFP修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-NSCs组)和20Gy照射后GFP-BDNF修饰的神经干细胞移植组(R+GFP-BDNF-NSCs组)。照后4周进行神经干细胞移植,采用PCR及Western Blot法检测移植后2周、8周、14周突触前蛋白突触素(Synaptophysin)和突触后蛋白突触后致密物95(PSD95)的含量,用免疫荧光染色技术观察移植后8周、14周海马DG区Synaptophysin表达水平。结果.:在移植后2周、8周、14周,与R组相比,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内Synaptophysin mRNA表达水平及蛋白表达水平明显升高;在移植后14周,R+GFP-BDNF-NSCs组大鼠海马内PSD95 mRNA水平及蛋白表达水平明显升高;在移植后8周、14周,R+GFP-BDNF-NSCs组DG区Synaptophysin表达水平明显增高。结论:过表达BDNF的神经干细胞移植到受照大鼠海马区后,Synaptophysin表达水平明显升高;移植后14周,PSD95表达也升高,可以一定程度上促进海马区突触生长。