背景:急性肺损伤（Acutelunginjury,ALI）是一种以严重的低氧血症,气道功能障碍和肺部不受控制的炎症为表现的急性临床综合征。越来越多的研究发现巨噬细胞的激活和M1表型的转化在肺部炎症的发展中起着重要的作用。线粒体作为一种与能量代谢密切相关的细胞器,无论是细胞的存活还是凋亡均与其功能密切相关。有研究认为,用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和IFN-γ刺激巨噬细胞时,巨噬细胞线粒体会发生明显的代谢重编程,这种代谢重编程对于巨噬细胞介导的免疫功能至关重要。基于间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）的细胞疗法逐渐成为治疗ALI有希望的候选者,MSCs在调控巨噬细胞炎症反应的同时,巨噬细胞也可以调节干细胞的自我更新,并动员干细胞向炎症部位募集,进而提高MSCs的炎症负调控作用。最近的研究表明,在各种疾病模型中,MSCs和MSCs衍生的外泌体都有减轻肺损伤和炎症的潜力。外泌体可以通过旁分泌机制与其他细胞相互作用,介导细胞间的调控基因进行通信,或者通过细胞间相互作用而被内在化,并通过配体-受体途径导致生物学反应。与干细胞移植相比,外泌体具有更稳定和可储存,没有非整倍性的风险以及免疫排斥可能性更低的优势,已具有构成安全、有效的无细胞治疗的潜力。有多项研究集中于MSCs的外泌体对免疫细胞的作用,包括巨噬细胞,T淋巴细胞,树突状细胞和自然杀伤细胞等;但是,关于脂肪来源的MSCs（Adipose Mesenchymal Stem Cells,AdMSCs）外泌体与巨噬细胞之间的串扰却知之甚少,两者的相互作用机制值得我们进一步去探索。目的:验证脂肪间充质干细胞来源的外泌体对急性肺损伤的治疗作用,探讨外泌体通过调控巨噬细胞线粒体代谢,提高巨噬细胞抑炎作用的效应分子机制,为外泌体治疗免疫炎症疾病提供可靠科学证据,以期为外泌体治疗免疫相关炎症疾病找寻新的研究思路和方案。方法:1)从人体脂肪组织中分离扩增AdMSCs,并采用差速离心法从细胞培养上清中收集AdMSC-exos。30只健康清洁级成年雄性C57BL/6小鼠随机分成三组:正常对照组（Ctrl组）、模型对照组（PBS组）、AdMSC-exos移植组。除Ctrl组外,其余两组通过气管内滴注LPS溶液诱导小鼠肺损伤急症模型,造模后4小时分别通过尾静脉移植PBS或AdMSC-exos。造模24小时后,获取肺脏组织行H&E染色,通过流式细胞术检测肺泡灌洗液中炎症细胞分类,ELISA和qPCR观察小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10等炎症因子表达水平。同时利用MH-S（肺泡巨噬细胞细胞系）细胞开展体外实验,qPCR观察AdMSC-exos对LPS刺激后MH-S细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10等炎症因子表达水平及巨噬细胞极化的影响;Western blot检测LPS刺激后在AdMSC-exos作用下MH-S细胞中NF-κB、MAPKs等炎症激活相关信号通路的变化。2)利用MH-S细胞开展体外实验,将AdMSC-exos预先加在培养MH-S细胞的培养上清中,半小时后加入LPS诱导MH-S炎症反应,观察AdMSC-exos对LPS刺激后的MH-S细胞线粒体功能的影响。通过透射电子显微镜观察MH-S细胞线粒体超微结构的变化。检测AdMSC-exos对MH-S增殖、凋亡的影响,以及细胞线粒体中mtDNA拷贝数、ATP含量、细胞ROS产量以及线粒体功能的影响,使用海马细胞能量/生物能量代谢实时测定仪（Seahorse XF Extracellular Flux Analyzers）分析细胞的耗氧量以及胞外产酸率。同时开展体内实验,首先将30只雄性C57BL/6小鼠随机分成三组:正常对照组（Ctrl组）、模型对照组（PBS组）、AdMSC-exos移植组。除Ctrl组外,其余两组通过气管内滴注LPS溶液诱导小鼠肺损伤急症模型,造模后4小时分别通过尾静脉注射PBS和AdMSC-exos。造模24小时后,使用共聚焦显微镜观察荧光标记的AdMSC-exos在小鼠肺部的分布情况,通过肺泡灌洗获得肺泡内的免疫细胞,将它们贴壁培养2小时后获得小鼠原代肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages,A:Ms）,进一步检测各组小鼠AMs中mtDNA拷贝数、ATP含量,通过流式细胞术检测AMs中细胞ROS产量、功能线粒体受损数量。再利用氯磷酸脂质体清除肺泡巨噬细胞,观察AdMSC-exos对肺泡巨噬细胞耗竭后小鼠的肺部保护作用。通过过继转移AdMSC-exos处理后的骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDM）,进一步观察外泌体对巨噬细胞线粒体代谢的影响。3)通过qPCR和Western blot检测外泌体中线粒体呼吸链复合物的表达。使用全能核酸酶降解AdMSC-exos 中的核酸成分,观察降解后的 AdMSC-exos 对 MH-S 炎症反应的抑制作用。通过 Western blot观察AdMSC-exos对小鼠肺泡巨噬细胞线粒体生物合成和转运的影响。体外实验中,将AdMSC-exos预先加在培养MH-S细胞的培养上清中,半小时后加入LPS诱导MH-S炎症反应,通过qPCR和western blot观察AdMSC-exos对LPS刺激后的MH-S细胞线粒体呼吸链复合物的影响。4)观察姜黄素预处理24小时后对AdMSCs及其衍生的外泌体的影响。使用CCK8法检测AdMSCs的活力,流式细胞术检测干细胞表面标志物CD105、CD90、CD45、CD34及干细胞凋亡情况,并观察姜黄素对干细胞多向分化能力的影响。通过差速离心法收集姜黄素预处理前后AdMSCs培养上清中的外泌体,Western blot检测外泌体常用标志物CD9、CD63、TSG101的表达,通过透射电镜、NTA粒径分析仪观察外泌体的表征形态和浓度。通过qPCR、Western blot检测姜黄素预处理后AdMSC-exos对LPS诱导MH-S细胞炎症反应的影响及NF-κB、MAPKs信号通路蛋白的表达。结果:1)经过脂肪间充质干细胞外泌体治疗后的ALI模型小鼠肺损伤症状得到有效缓解,肺部及全身的炎症反应减轻,肺组织及BALF中促炎性细胞因子水平降低,抑炎性细胞因子表达水平增高。AdMSC-exos移植后还可提高肺泡灌洗液中小鼠原代肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophages,AMs）数量,减少中性粒细胞和单核巨噬细胞的数量。体外实验中,AdMSC-exos可以促进MH-S细胞向M2型巨噬细胞分化,抑制炎症信号通路NF-κB、MAPKs上相关蛋白的磷酸化水平,增强巨噬细胞抵抗炎症反应的能力,减轻细胞炎症。2)AdMSC-exos将线粒体转移至MH-S细胞,并与MH-S线粒体内膜共定位。外泌体通过线粒体的转移对MH-S细胞线粒体功能有良好的促进作用。AdMSC-exos预处理可以改善LPS刺激后线粒体被破坏的现象,增加线粒体嵴的数量,恢复其正常结构,并提高MH-S细胞线粒体mtDNA拷贝数,增加线粒体ATP的产生,使线粒体功能受损的程度减轻,进一步促进细胞增殖减少凋亡,并且还提高了巨噬细胞氧化磷酸化和糖酵解能力。动物实验结果也表明,携带干细胞线粒体的AdMSC-exos可以被内化到小鼠肺组织巨噬细胞中。AdMSC-exos可以提高小鼠AMs细胞中mtDNA拷贝数,LPS刺激后细胞低ATP含量的形式被有效逆转。流式细胞仪分析结果显示,AdMSC-exos可以减少LPS刺激后AMs细胞ROS产量,线粒体功能受损的数量也大大下降。而对于耗竭掉AMs的ALI模型小鼠,AdMSC-exos 对肺组织损伤和炎症抑制 的保护作用明显减弱。使用 AdMSC-exos 预处理的 BMDM细胞过继转移后,也可以有效抑制LPS诱导的肺损伤和炎症反应。3)实验发现线粒体呼吸链复合物Ⅰ亚基NDUFV2以核酸和蛋白质两种形式存在于AdMSCs外泌体中。进一步的实验结果发现,当AdMSC-exos中核酸物质降解后,其调控受体巨噬细胞炎症反应的能力有所下降。qPCR和Western blot结果表明,LPS刺激会导致细胞线粒体呼吸链复合物上亚基Ⅰ～V的缺失,尤其是复合物INDUFV2的下调最为明显,而施用AdMSC-exos可以有效提高细胞线粒体复合物的表达。qPCR、流式细胞术等实验结果表明,当线粒体呼吸链复合物INDUFV2敲减后,AdMSC-exos对巨噬细胞的免疫抑制和改善线粒体代谢的能力被削弱。4)姜黄素预处理对干细胞的生长、形态、表型均无影响,也不会改变其衍生的外泌体表征。此外,姜黄素处理AdMSCs后,可以显著提高干细胞分泌的外泌体含量。在抑制炎症反应方面,使用姜黄素预处理AdMSCs后,可以增强AdMSC-exos降低炎症信号通路NF-κB、MAPKs上相关蛋白磷酸化水平的作用,有效减轻细胞炎症反应。结论:人脂肪间充质干细胞衍生的外泌体通过调控NF-κB、MAPKs信号通路抑制炎症反应,促进活化的巨噬细胞由促炎的M1型向抑炎的M2型极化,有效缓解LPS诱导的小鼠急性肺损伤;AdMSC-exos通过线粒体转移恢复巨噬细胞线粒体的结构完整性和生物遗传学,进一步促进内毒素应激的巨噬细胞向抗炎表型的功能转变,从而减轻ALI模型小鼠肺组织的损伤和炎症,AdMSC-exos的保护作用在很大程度上取决于线粒体转移和肺泡巨噬细胞的代谢重编程;AdMSC-exos中包含AdMSCs细胞中的线粒体呼吸链复合物NDUFV2片段,并通过转移定位到受体巨噬细胞的线粒体内膜上,继而调整巨噬细胞由于线粒体呼吸链复合物缺失引起的线粒体功能障碍,起到抑制炎症反应的作用。同时,姜黄素预处理AdMSCs后可以增加干细胞外泌体的产量,极大地提高了外泌体的提取效率,并且还可提高AdMSC-exos抵抗巨噬细胞炎症反应的能力。总的来说,外泌体治疗代表了一种有前景的无细胞疗法,包含线粒体片段转移的外泌体也为临床治疗线粒体功能障碍相关的疾病提供了新的见解,中医药与干细胞疗法的联合运用可以起到相辅相成的作用,这一思路也为临床上治疗多种免疫炎症疾病提供更多选择。