肺癌是常见的恶性肿瘤之一,其死亡率和发病率在世界范围的肿瘤性疾病中均居高不下。其主要原因是早期诊断率低而预后差。肺癌的发生是多基因参与的多阶段、多步骤的复杂过程,为能够提高肺癌患者的存活率,实现肺癌的早期临床诊断是迫在眉睫需要解决的问题。近年来,随着对肺癌发生、发展的细胞分子生物学机理的了解,利用有效的细胞分子生物学标志用于肺癌的早期诊断有着令人乐观的前景。其中甲基化是抑癌基因失活的主要机制之一,而p16基因启动子区异常甲基化被认为是肺癌发生中的一起早期事件。目前人们检测p16基因甲基化的经典方法之一是甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法。但该方法灵敏度有限,操作起来繁琐费时,并且无法实现自动化,使临床应用受到很大限制,于是发展一种快速、简便、准确、灵敏、高效的检测方法十分必要。本研究通过建立利用微流控芯片检测p16基因异常甲基化的方法,简化了传统繁琐的步骤,即利用微流控芯片代替以往的琼脂糖凝胶电泳,不但节省了时间,更重要的是大大提高了灵敏度及特异性,并且可以进行阵列式检测,提高了效率。本实验利用双盲实验检测肺癌患者肿瘤、血浆及其他肿瘤和非肿瘤患者血浆中的p16基因异常甲基化,探讨微流控芯片检测方法的灵敏度及特异性等,以期建立一种崭新而可靠的早期肺癌临床诊断方法。 <WP=5>方法:通过对采集到的肿瘤患者肿瘤标本、血浆标本及其他肿瘤和非肿瘤患者的血浆标本提取DNA,然后利用亚硫酸氢盐对其DNA进行碱基转化,使甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,而非甲基化的胞嘧啶不发生改变,之后通过经典的甲基化特异性PCR对其进行扩增反应,然后对扩增产物分别利用传统的琼脂糖凝胶电泳及新的微流控芯片方法进行检测,比较其灵敏度及特异性有无差异。结果:1、琼脂糖凝胶电泳方法检测结果:利用琼脂糖凝胶电泳检测30例甲基化阳性对照标本均为阳性,30例甲基化阴性对照标本均为阴性。44例肺癌患者血浆标本及40例肿瘤标本甲基化检测均为阴性。20例其他肿瘤及20例非肿瘤患者血浆标本甲基化检测也均为阴性。2、微流控芯片方法检测结果:利用微流控芯片检测30例甲基化阳性标本,结果均为阳性;30例甲基化阴性标本中,3例阳性,其余27例为阴性。在44例肺癌患者血浆标本中,13例甲基化检测为阳性,其余31例甲基化检测为阴性;在40例肿瘤标本中,11例甲基化检测为阳性,其余29例甲基化检测为阴性。在20例其他肿瘤患者血浆标本中,4例甲基化检测为阳性,其余16例检测为阴性。在20例非肿瘤患者血浆标本中,2例甲基化检测为阳性,其余18例检测为阴性。微流控芯片的方法检测灵敏度为100%(30/30),特异性为90%(27/30)。经配对资料X2检验分析证明:利用微流控芯片方法与传统的琼脂糖凝胶电泳方法相比较,两者的检出率不同(P<0.005)。且微流控芯片方法的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳方法。结论:微流控芯片与琼脂糖凝胶电泳相比,其检测灵敏度较后者提高至少27.5%,其特异性为90%,进一步提高其检测特异性,可以使其高灵敏度更加可信,从而有助于低丰度p16甲基化异常的检出,更加准确地反映出病人p16甲基化状态,使病人血浆中的p16基因甲基化的异常改变可能成为辅助肺癌早期诊断和高危人群筛选的分子标记物,而且在提示肺癌病人的预后和治疗方面有广阔的应用前景。