研究背景近年来,造成人类感染性疾病的病原体日益增多,且随着抗生素的滥用现象加重,耐药性菌株也逐渐增多,这对病原体的鉴定和感染性疾病的诊断带来了新的挑战。因此,对病原体的早期、快速、准确的鉴定,可以指导临床合理用药,有效降低感染性疾病对人类健康的危害,对于临床微生物学具有重要意义。目前,临床上对病原体的检测主要依赖于传统的细菌培养和鉴定方法,但该方法操作繁琐,检测所需周期较长,尚不能满足临床快速诊断的实际需求。近年来,随着物理技术的不断发展,以太赫兹光谱和拉曼光谱为代表的新型光谱技术正逐步应用于病原体的检测中,提供了一种病原体无标记检测新策略。太赫兹光谱和拉曼光谱同属分子振动光谱,可利用光谱“指纹图谱特征”对微生物种属进行鉴别,且该方法具有快速、无标记、无需试剂、低成本等优势,具有广阔的应用前景。本研究以三种芽孢杆菌、三种念珠菌为模式生物,分别应用太赫兹光谱技术和拉曼光谱技术进行检测,初步探讨了无标记光谱技术用于病原体检测的可行性。研究目的本研究以三种芽孢杆菌、三种念珠菌为模式生物,分别使用THz-TDS(THz timedomain spectroscopy,太赫兹时域光谱)仪和拉曼光谱(Raman spectroscopy)对其进行检测,比较两种光谱各自的优势和特点,从理论和技术上探讨太赫兹技术和拉曼技术用于病原体快速检测的可行性。研究方法1.收集三种芽孢杆菌样本,使用冷冻干燥机抽空水份制成冻干粉末,与聚氯乙烯粉进行不同质量比例混合并压制成圆形薄片,使用太赫兹时域光谱仪在透射模式下检测,探讨THz技术在粉末样本中进行芽孢杆菌定量检测的能力。2.使用聚乙烯垫片和3M双面胶纸制作出适用于病原体菌落检测的样本检测池,刮取培养后的三种芽孢杆菌菌落于检测池上,使用太赫兹时域光谱仪在透射模式下检测,探讨繁殖体状态下不同病原菌的太赫兹光谱差异。3.收集三种念珠菌样本,制备成冻干粉末,用红外压片机压制成圆片,利用太赫兹时域光谱仪在透射模式下检测。4.三种念珠菌固体培养后,刮取菌落于自制检测池上,利用太赫兹时域光谱仪在透射模式下检测。5.测量不同病原菌冷冻干燥前后的质量变化,计算出其样本中的含水量,并与太赫兹光谱检测结果进行比对。6.三种芽孢杆菌采用固体培养基培养后,分别挑取各自菌落均匀涂抹于氟化镁晶片上,利用显微拉曼光谱仪进行检测,并结合PCA(principal component analysis,主成分分析)的统计学方法对拉曼测量结果进行分析,研究拉曼光谱用于区分不同芽孢杆菌的可行性。7.三种念珠菌采用固体培养基培养后,分别挑取各自菌落均匀涂抹于氟化镁晶片上,利用显微拉曼光谱仪进行检测,并结合PCA分析法对测量结果进行分析。研究结果1.芽孢杆菌压片的太赫兹测量结果表明,可通过吸收系数的差异区分细菌的不同含量;不同芽孢杆菌纯的细菌冻干粉压片的吸收系数由大到小依次为:枯草芽孢杆菌最大、蜡状芽孢杆菌次之、苏云金芽孢杆菌最小,使用太赫兹波的吸收系数可有效鉴别三种芽孢杆菌冻干粉。2.三种芽孢杆菌菌落在太赫兹波段的吸收系数随频率的增大而逐渐升高,吸收系数由大到小依次为:枯草芽孢杆菌最大、苏云金芽孢杆菌次之、蜡状芽孢杆菌最小,通过吸收系数的差异,太赫兹波能够鉴别三种芽孢杆菌。此外,细菌在菌落状态下的吸收远大于在冻干状态下的吸收,说明菌落中的水分在整体太赫兹吸收中占有较大比例,细菌在不同生存状态下具有不同的太赫兹光谱响应特征。3.三种念珠菌在太赫兹波段的吸收也随频率的增大而逐渐升高,冻干粉吸收系数由大到小依次为:白色念珠菌最大、光滑念珠菌次之、热带念珠菌最小,菌落吸收系数由大到小依次为:白色念珠菌最大、热带念珠菌次之、光滑念珠菌最小,太赫兹波能够有效将三种念珠菌鉴别开来。4.细菌含水量测试结果为:枯草芽孢杆菌最大、苏云金芽孢杆菌次之、蜡状芽孢杆菌最小,真菌含水量测试结果为:白色念珠菌最大、热带念珠菌次之、光滑念珠菌最小,因此对于细菌和真菌,其含水量高低顺序均与菌落吸收系数的大小顺序一致,即含水量越高的病原体吸收系数越高。5.三种芽孢杆菌拉曼光谱谱线具有微细的差异,拉曼光谱信息丰富,特征峰明显而尖锐,采用平滑处理后的光谱数据结合PCA分析法可以有效鉴别三种芽孢杆菌。6.三种念珠菌的拉曼光谱谱线轮廓近似程度较高,难以用肉眼直接区别,对平滑处理后的光谱数据进行PCA分析表明,三种念珠菌的三维散点图存在部分交叉融合,难以完全将三者鉴别开来。研究结论1.太赫兹波能够有效鉴别病原体的不同状态;此外冻干粉末或是繁殖体状态的菌落,太赫兹波均可以鉴别不同类型的病原体;太赫兹波还可区分细菌冻干粉的不同含量,展现出其用于病原体定量检测的潜能。2.由于水在太赫兹波段吸收强烈,而病原体含水量高低顺序与菌落的太赫兹吸收系数的大小顺序一致,因此我们推测对于组成成分和结构相似的病原体,太赫兹波能通过其胞内水的微小差异进行鉴别。3.拉曼光谱检测病原体时,光谱信息复杂、丰富,特征峰明显、尖锐,对于亲缘关系远的病原体,可直接根据特征峰的位置差异进行鉴别;而对于同属不同种的细菌、真菌,则可结合化学计量分析手段分析进行结果判读。4.太赫兹光谱虽无明显特征峰,但可通过吸收系数数值大小区分不同病原体,其检测简便快速,结果可直接判断,无需借助化学计量手段,特别对于真菌的检测,由于真菌荧光干扰较强,运用显微拉曼光谱技术仅结合主成分分析法无法有效鉴别,太赫兹光谱用于病原体检测更具优势。