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植物锈菌病害是危害农业生产的重要病害之一,发病率高,寄主种类多,经济损失大。其中甘蔗黑顶柄锈菌和咖啡驼孢锈菌是危害严重,发生比较普遍的两类专性寄生病原菌,前者引起甘蔗褐锈病,而后者导致咖啡叶锈病,目前针对这两种锈菌还没有非常有效的防治措施,特别是缺乏相关的病害检测技术,因此建立上述两种病菌的快速检测技术对于病害监测与防控具有十分重要的意义。环介导等温扩增方法(LAMP)由于具有高特异性、高灵敏性,以及简便、快速和低成本等特点,已在诸多领域广泛应用。为了建立甘蔗褐锈病菌和咖啡叶锈病菌的LAMP检测技术,本研究进行了如下五个方面的研究。首先,通过对锈菌ITS序列进行比对分析,获得甘蔗褐锈病菌和咖啡叶锈病菌的特异性区域;利用 primer explorer 4.0 软件(http://primer explorer.jp/ela mp4.0.0)对特异性区域进行LAMP引物组设计。进一步通过引物组筛选获得二者最佳引物BRSC4和HVSC2。其次,基于各自最佳引物组,对25 μL LAMP反应体系和反应条件进行了优化。优化后甘蔗褐锈病菌LAMP反应体系各组份为:0.2 μM F3和B3,1.2 μM FIP 和 BIP,1mMdNTPs,6mMMgS04,2.5 μL10×buffer,8U Bst-DNA 聚合酶,1μL模板;而优化后咖啡叶锈病菌LAMP反应体系各组分为:0.2 μM F3和 B3,1.6μM FIP 和 BIP,1.4 mM dNTPs,4 mM MgS04,2.5 μL 10×buffer,8U Bst-DNA聚合酶,1μL模板。两种锈菌LAMP反应程序相同:LAMP反应体系63℃,反应60min;85℃,8min。第三,分别以甘蔗褐锈病菌和咖啡叶锈病菌ITS基因重组质粒DNA为模板,以甘蔗和咖啡上的其他病原真菌以及不同属的病原菌DNA为待测样品开展特异性分析。结果表明,只能从甘蔗褐锈病菌和咖啡叶锈病菌ITS基因重组质粒DNA模板中扩增出阶梯状条带,而其他非靶标模板DNA均未扩增出任何条带。第四,分别以甘蔗褐锈病菌和咖啡叶锈病菌ITS基因重组质粒DNA梯度稀释液为模板,对所建立的LAMP、常规PCR和巢式PCR检测技术的灵敏度进行比较。结果显示,甘蔗褐锈病菌LAMP与巢式PCR技术的最低检测限均为10-3 ng/μL,而常规PCR技术的最低检测限仅为10-1 ng/μL;咖啡叶锈病菌LAMP技术的最低检测限为10-5 ng/μL,常规PCR技术的最低检测限为10-1 ng/μL,巢式PCR技术的最低检测限则是10-4ng/μL。最后,进一步利用建立的LAMP检测技术以及常规PCR、巢式PCR技术对甘蔗和咖啡田间病样进行检测。结果表明,就甘蔗褐锈病菌而言,LAMP技术其检出频率为80%,巢式PCR技术检出频率为76%,常规PCR技术平均检出频率为52%。而在咖啡叶锈病菌方面,LAMP技术检出频率为97.8%,巢式PCR技术检出频率则是95.6%,而常规PCR技术平均检出频率为89.0%。