甲状腺癌(thyroid carcinoma, TC)目前是头颈部最多见的内分泌系统恶性肿瘤，发病率逐年升高，并且呈现出了年轻化趋势。其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)在甲状腺癌中占比最高，达85%左右。我国对于甲状腺癌的诊断主要依靠影像学技术，治疗则以手术治疗为主。治疗后，大部分患者的预后良好，但仍有20%的甲状腺乳头状癌患者早期发生远处转移以及浸润到周围正常组织而导致其死亡率逐年增加。细胞周期作为细胞生命活动的基础，是一种非常精细的调节过程。研究发现，细胞周期调节的失衡会导致多种肿瘤基因的异常表达，从而使肿瘤细胞的增殖调节失衡，最后引起肿瘤的发生发展。甲状腺癌的发生发展与癌细胞周期的调节失衡关系密切，因此，寻找参与调节甲状腺癌细胞周期的基因至关重要。课题组所研究的三叶因子3（trefoil factor 3,TFF3）与甲状腺癌的发生发展相关，且具有癌基因的潜能。而关于TFF3是否参与甲状腺乳头状癌细胞周期的进程学者们研究甚少。课题组在前期的工作中发现TFF3在甲状腺乳头状癌中存在高表达现象，本实验在前期研究的基础上，进一步探讨， TFF3对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1和BCPAP两细胞株细胞周期的影响以及分子机制。
　　首先对正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1、甲状腺乳头状癌细胞TPC-1和BCPAP进行培养，通过Real Time-PCR和Western blot检测TPC-1、BCPAP、Nthy-ori 3-1中TFF3表达情况。观察甲状腺乳头状癌细胞和正常甲状腺细胞中TFF3的表达差异。
　　然后培养慢病毒转染工具细胞293T，将慢病毒表达载体pLVX-shRNA2-Puro-TFF3和阴性对照载体pLVX-shRNA2-Puro分别与HIV混合包装质粒在转染试剂的作用下转入293T细胞。将得到的慢病毒液分别感染甲状腺乳头状癌细胞TPC-1和BCPAP，获得稳转细胞株shTFF3-TPC-1（沉默TFF3的TPC-1细胞株）、shRNAC-TPC-1（阴性对照的TPC-1细胞株）、shTFF3-BCPAP（沉默TFF3的BCPAP细胞株）、shRNAC-BCPAP（阴性对照的BCPAP细胞株）。应用Western blot技术分别检测TPC-1和BCPAP两株细胞中TFF3的沉默效率。
　　随后应用流式细胞技术检测shTFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、shTFF3-BCPAP、shRNAC-BCPAP四株细胞的细胞周期变化。以细胞生长曲线、细胞克隆实验检测沉默TFF3组甲状腺乳头状癌TPC-1和BCPAP的细胞生长状况。
　　最后应用Real Time-PCR技术检测shTFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、shTFF3-BCPAP、shRNAC-BCPAP四株细胞中细胞周期标志物（P21、P27、CDK4、CyclinD1）的mRNA转录水平的变化；应用Western blot技术检测shTFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、shTFF3-BCPAP、shRNAC-BCPAP四株细胞中细胞周期标志物（P21、P27、CDK4、CyclinD1）及PI3K/AKT信号通路相关蛋白AKT、pAKT的蛋白表达情况；应用免疫细胞化学染色检测shTFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、shTFF3-BCPAP、shRNAC-BCPAP四株细胞中细胞周期标志物（P21、P27、CDK4、CyclinD1）的蛋白表达变化。
　　结果表明：TFF3在甲状腺乳头状癌细胞TPC-1、BCPAP中表达比在正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1中表达明显增高（P＜0.01）；慢病毒转染后，沉默TFF3组细胞shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP中TFF3的表达水平明显低于阴性对照组shRNAC-TPC-1、shRNAC-BCPAP（P＜0.01）且沉默TFF3组细胞shTFF3-BCPAP形态发生变化，细胞由圆形变成了梭形或多边形，细胞体积变小。
　　细胞周期结果示：与对照组细胞shRNAC-TPC-1、shRNAC-BCPAP相比，实验组细胞shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP的G1期细胞比例增加（P＜0.05），而S期、G2期细胞比例减少（P＜0.05）；细胞生长曲线的测定结果表明，从接种细胞第一天开始，shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP细胞生长就明显滞后于对照组细胞shRNAC-TPC-1、shRNAC-BCPAP，细胞生长速度减慢（P＜0.01）；细胞克隆形成能力，与对照组细胞shRNAC-TPC-1、shRNAC-BCPAP相比，shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP组细胞克隆数明显下降（P＜0.01）。
　　Real Time-PCR结果显示：沉默TFF3组细胞shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP中P21、P27mRNA的转录水平升高（P＜0.05），而CyclinD1、CDK4mRNA的转录水平降低（P＜0.01）；与对照组细胞相比较，实验组沉默TFF3后，shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP中P21、P27的蛋白表达水平升高（P＜0.05），而CyclinD1、CDK4的蛋白表达水平降低（P＜0.01）,四组细胞中PI3K信号通路相关蛋白Akt表达无明显差异（P＞0.05）,而pAkt蛋白表达在shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP中明显降低（P＜0.01）；免疫细胞化学染色结果显示：P21、P27在胞浆、胞核均有表达，但在shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP组细胞的细胞核中阳性信号增强（P＜0.01），细胞质中阳性表达降低（P＜0.01），而CyclinD1和CDK4阳性信号位于胞核，且在shTFF3-TPC-1、shTFF3-BCPAP中CyclinD1和CDK4蛋白表达降低（P＜0.01），而在shRNAC-TPC-1、shRNAC-BCPAP组细胞CyclinD1和CDK4蛋白表达增高（P＜0.01）。
　　综上实验结果说明：TFF3与甲状腺乳头状癌细胞周期有关，沉默TFF3可明显延长甲状腺乳头状癌细胞周期，从而抑制细胞的增殖。三叶因子3（TFF3）可能通过PI3K/Akt信号通路调节甲状腺乳头状癌细胞周期的进程。