论文部分内容阅读
背景及目的:DNA聚合酶β（DNA polymeraseβ,DNApolβ）的功能主要是在碱基切除修复（base excision repair,BER）的过程中填补单核苷酸缺口。在细胞的正常分化以及DNA的正常复制与修复中,DNApolβ在细胞内是低水平表达的。当DNApolβ突变、表达及功能出现异常时,可以导致细胞自身突变率增加、遗传不稳定性的发生以及对一些抗癌药物的耐受。因此研究DNApolβ对肿瘤的发生、发展及对抗癌药物的耐受性问题都有重大意义。我省林州市是食管癌高发区,其粮食中提取出的互隔交链孢毒中分离出有七种毒素,其中互隔交链孢酚（Alternariol,AOH）和互隔交链单甲醚（Alternariol methyl ether,AME）已被证实有较强的致癌性,能够损伤DNA,诱发DNApolβ表达增高。究竟引起DNApolβ表达增高是经由哪条通路,如果阻断这条通路是否可以逆转DNApolβ表达增高的趋势成为关心的焦点。信号通路的有关研究表明,在致癌物烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝胍（MNNG）处理细胞中cAMP含量、PKA活性和CREB133位丝氨酸残基磷酸化程度都有一过性升高,提示MNNG诱使DNApolβ升高是通过cAMP-PKA-CREB途径介导。本实验旨在探讨另一主要代谢产物互隔交链孢霉素（Altenuene,ALT）对DNApolβ表达的影响以及是否是由cAMP—PKA—CREB的信号转导通路介导。方法:1.采用适宜的低浓度ALT处理小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）,利用免疫细胞化学、RT-PCR及Western Blotting方法测定ALT对细胞中DNApolβmRNA以及蛋白表达的影响。2.采用ALT作用与NIH3T3细胞,通过放射免疫方法测定细胞中cAMP的含量;Western Blotting、免疫细胞化学等方法检测细胞中PKA催化亚基及p-CREB蛋白水平的表达,观察cAMP-PKA-CREB信号通路是否被激活。3.利用PKA阻断剂H89预处理细胞后,再观察ALT对PKA、p-CREB及DNApolβ表达的影响。4.实验组与对照组数据的比较用SPSS11.0软件进行分析,两两均数间用t检验,多样本均数间采用方差分析,α=0.05为检验水准。结果:1.采用15μmol/LALT处理细胞后,实验组与阳性对照组细胞的DNApolβmRN以及蛋白含量与溶剂对照组相比升高。（P＜0.05）2.分别采用0、5、10、15、20μmol/LALT处理细胞30分钟后,利用125Ⅰ标记的放射免疫法测定细胞中cAMP含量,发现细胞cAMP水平随着ALT的浓度增加而增加,与溶剂对照组比较差异有统计学意义。（P＜0.05）3.采用15μmol/LALT处理细胞后,实验组与阳性对照组细胞的PKA催化亚基含量与溶剂对照组相比升高,加上H89先行阻断后,PKA催化亚基比单纯加ALT时升高程度有所下降。（P＜0.05）4.采用15μmol/L ALT处理细胞后,实验组与阳性对照组细胞的p-CREB蛋白含量与溶剂对照组相比升高,加上H89先行阻断后,p-CREB比单纯加ALT时升高程度有所下降。（P＜0.05）结论:1.证实了互隔交链孢霉素可以诱导NIH3T3细胞的DNApolβ的表达上调。2.NIH3T3细胞面对一定浓度的ALT损伤作用时,细胞内的cAMP含量、PKA催化亚基及p-CREB表达均有一过性增强。提示ALT处理细胞后,DNApolβ表达上调是经由cAMP-PKA-CREB途径介导的。而在NIH3T3细胞中加入PKA抑制剂H89阻断PKA下游的激活后再加入ALT,,检测到p-CREB及DNApolβ表达水平有所降低,提示可以利用阻断信号转导通路的方法干预DNApolβ的异常表达。