牙周组织疾病、口腔颌面部外伤、生长发育畸形和颌面部肿瘤等引起的牙槽骨缺损的治疗一直是口腔医学研究的难点,备受口腔医学学者的关注。近年来,随着骨组织工程研究的深入,该方法为牙槽骨缺损的修复和再生开辟了新的思路。由于具有良好的自我增殖和分化潜能,骨髓间充质干细胞(BMSCs)已然成为了应用十分广泛的种子细胞。然而,组织工程骨的血管化问题以及外源性支架材料的免疫排斥和细胞利用率低等问题,阻碍了骨组织工程的广泛应用。因此,本实验拟应用细胞膜片技术,将血管内皮祖细胞(EPCs)与BMSCs直接共培养,经成膜诱导后,构建出复合细胞膜片,以修复大鼠牙槽骨缺损。我们希望通过构建EPC/BMSC复合细胞膜片,探索有利于BMSCs成骨分化能力的更好的微环境,以提高BMSCs的骨再生能力,为提供效率更高的干细胞治疗牙槽骨缺损修复与再生的方法奠定理论基础。研究目的:1.分离培养BMSCs及EPCs,构建EPC/BMSC复合细胞膜片。2.研究EPC/BMSC复合细胞膜片的成骨能力,探索提高BMSCs成骨能力的微环境。3.观察EPC/BMSC复合细胞膜片修复大鼠牙槽骨缺损的效果,探寻采用复合细胞膜片修复牙槽骨缺损的新方法。研究内容与方法:1.分离获得BMSCs的方法本实验选择密度梯度离心法结合贴壁法,所培养细胞的形态通过倒置显微镜来观察,细胞表面分子的表达通过流式细胞技术来检测,并对细胞进行成骨、成脂方向诱导,检测多向分化能力。2.采用密度梯度离心法结合差速贴壁法,在内皮细胞培养基条件下分离并培养EPCs,对培养的细胞进行形态学上的连续性观察,应用流式细胞技术检测所培养细胞的表面分子表达情况、并采用双荧光染色等方法对EPCs进行鉴定。3.将EPCs与BMSCs直接共培养,经成膜诱导后,构建出EPC/BMSC复合细胞膜片,并对膜片进行HE染色及扫描电镜观察。4.将EPCs及BMSCs分别用Di I及Di O荧光染料标记,观察复合细胞膜片中两种细胞的分布情况;应用TUNEL法检测细胞膜片中细胞的凋亡情况。5.对细胞膜片进行ALP及茜素红染色,并对ALP活性及钙化结节表达情况进行检测和分析;应用Real-time PCR及Western blot检测手段对成骨及成血管相关指标的表达情况进行检测;ELISA检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。6.建立大鼠牙槽骨缺损模型,将细胞膜片移植入骨缺损区,对移植术后的标本进行大体观察,Micro-CT扫描、BV/TV及TMD相关检测,并进行HE及Masson染色,观察骨缺损修复情况。实验结果:1.培养的BMSCs形态多为纺锤形或多角形,可稳定传代;对于间充质干细胞表面标志物,培养的细胞高表达;对于造血干细胞表面标志物,培养的细胞几乎不表达;培养的细胞具有能够向成骨、成脂方向分化的能力。2.培养的EPCs,早期细胞形态为长梭形,晚期细胞呈现铺路石样;细胞双重表达内皮细胞及造血干细胞表面标志物;细胞阳性表达内皮细胞特异性分子v WF;细胞Di I-ac-LDL与FITC-UEA-1双重荧光染色呈阳性表达。3.将EPCs与BMSCs直接共培养,经成膜诱导10天后,可获得EPC/BMSC复合细胞膜片,膜片呈现半透明膜样结构,可直接完全从培养皿内分离获得。组织学观察结果显示获得的细胞膜片具有一定厚度,由多层细胞及细胞外基质构成。4.随着直接共培养后成膜诱导时间的延长,EPC/BMSC复合细胞膜片中两种细胞的胞膜出现某种程度的细胞膜交换现象。此外,与对照组(单一BMSC膜片、单一EPC膜片)相比,复合细胞膜片具有较低的细胞凋亡率。5.EPC/BMSC复合细胞膜片中碱性磷酸酶和钙化结节的表达情况高于对照组(单一BMSC膜片、单一EPC膜片);复合细胞膜片中成骨及成血管等相关指标的表达亦高于对照组,差异具有统计学意义。6.在不同观察时间点,EPC/BMSC复合细胞膜片对大鼠牙槽骨缺损的修复能力均强于单一BMSC膜片组与单一EPC膜片组。结论:1.EPC/BMSC复合细胞膜片在体外具有较强的成骨及成血管能力。2.EPC/BMSC复合细胞膜片中EPCs与BMSCs间存在某种程度的细胞交流现象。3.EPC/BMSC复合细胞膜片可以明显增强大鼠牙槽骨缺损的修复能力,为牙槽骨缺损的组织工程修复提供了新的研究思路。