KGD多肽与尿激酶原嵌合分子的构建、表达及性质研究

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基于以往的研究,野生型人尿激酶原的第138-139位点适于插入外源肽序列,在此位点插入含KGD功能序列的多肽可以构建兼具抗栓及溶栓活性的尿激酶原突变体。我们设计不同的含KGD功能序列的多肽,利用重叠延伸PCR技术构建了三个KGD-尿激酶原突变体全长基因,然后将其克隆到杆状病毒表达载体上,并用其中的KGDS-尿激酶原突变体重组杆状病毒载体转染昆虫细胞Sf9,在多角体启动子作用下,对KGDS-尿激酶原突变体全长基因进行瞬时表达,通过对突变体蛋白质性质的分析来检测KGD功能多肽的边侧序列对KGD功能多肽抗血栓活性展现的作用。研究表明,KGDS-尿激酶原突变体在昆虫细胞中成功进行了表达。通过对表达产物的纤溶活性的测定确定不同时期突变体基因的表达情况。通过离子交换层析和分子筛层析的方法对KGDS-尿激酶原突变体蛋白质进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测尿激酶原突变体蛋白质的分子量。纤维平板溶解圈实验法表明KGDS-尿激酶原突变体蛋白质具有较强的纤溶活性,但是血小板聚集实验检测表明KGDS-尿激酶原突变体蛋白质血小板聚集抑制活性很弱,这表明KGDS功能多肽中的边侧S(丝氨酸)影响了KGD功能序列的血小板聚集抑制活性。
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