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流感即流行性感冒,是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病。流感病毒属于正黏科病毒,可分为甲、乙、丙三种类型。甲型H3N2流感病毒是最常见的季节性流感病毒,也是目前多价流感疫苗中主要组成部分。流感疫苗以鸡胚培养法生产的传统疫苗为主,这种传统生产工艺虽然成熟,但存在产量不稳定、生产周期长、病毒易变异、易引起过敏反应等缺点。相对于鸡胚,生物反应器大规模生产细胞基质流感疫苗工艺生产过程操作简单且易于控制,生产周期短,自动化程度高,疫苗质量稳定、安全,具有绝对优势。而MDCK细胞为目前公认的对流感病毒敏感的细胞株之一。本研究将甘肃省动物细胞工程技术研究中心保存的MDCK细胞,按照《中华人民共和国药典》(三部)对生产疫苗用细胞要求,从生物学特性、微生物污染和遗传特性鉴定建立MDCK细胞库,其复苏活力为96%,培养48h细胞生长致密单层,形态多呈三角形和不规则多角形,与冻存前的形态基本一致;生长曲线呈“S”型,最大增殖密度为5.45×10~5cells/mL,倍增时间为23.2h,连续培养10代时形态和生长速度保持一致;真菌、细菌、支原体和内、外源病毒因子检测为阴性;染色体众数在78～82之间。通过生长特性研究筛选用于培养MDCK细胞的培养基和载体。结果表明,MDCK细胞用DMEM培养基培养倍增时间为20.2h,最大增殖密度9.58×10~5cells/mL,传代培养10代生长良好,优于DM/F12、MEM和M199培养基;生物反应器Cytodex-1微载体和片状载体培养MDCK细胞。结果表明,Cytodex-1微载体和片状载体均能支持MDCK细胞生长,但是在相同体积的反应器中片状载体培养MDCK细胞最大增殖密度6.18×10~6cells/mL明显高于Cytodex-1微载体3.21×10~6cells/mL,因此本研究选用片状载体培养MDCK细胞,进行后期试验研究。生物反应器片状载体培养建库的MDCK细胞增殖甲型H3N2流感病毒并对增殖条件进行优化。结果表明,本研究中生物反应器增殖甲型H3N2流感病毒最优TPCK-胰酶浓度为2.5μg/mL,最优MOI为0.01;当所收获的病毒液用于生产流感疫苗时,收毒时间以72h为宜;当所收获的病毒液作为继续扩增流感病毒的种毒时收毒时间以60h为宜。通过本研究,优化了高密度培养MDCK细胞增殖甲型H3N2流感病毒的条件,为生物反应器培养哺乳动物细胞生产流感疫苗的大规模生产提供参考依据。