研究背景子痫前期(Preeclampsia,PE)是妊娠20周后新发的高血压、蛋白尿等为主要表现可累及全身多个脏器的妊娠期特发疾病,是导致孕产妇和围产儿死亡的重要原因。世界范围内PE的发病率约为2-8%,发病孕周越小,危害越大。根据子痫前期发病孕周,分为早发子痫前期(发生于34周之前)和晚发子痫前期(发生于34周或34周之后)。早发子痫前期发病率低,但是病情重,围产儿预后差,更容易合并严重的并发症,不仅再次妊娠复发率高,其子代患子痫前期及心血管系统疾病的风险也越高。研究认为早发子痫前期主要是胎盘源性疾病,而晚发子痫前期较多的是母源性疾病,可能有不同的发病机制,但PE具体的发病机制至今不明。目前子痫前期最有效的治疗方式仍为终止妊娠、娩出胎盘。广泛认为子痫前期发生及发展的病理根源在于胎盘滋养细胞功能异常。胎盘滋养细胞与肿瘤细胞有很多相似之处,但是在人体众多因子的调控下,滋养细胞的功能呈现严格的时间和空间的精细调控,滋养细胞侵袭能力不足可能与胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)、子痫前期的发病相关,而其侵袭能力过强可导致葡萄胎、绒癌等妊娠滋养细胞疾病的发生。虽然PE发病于妊娠20周后,但是胎盘滋养细胞功能异常可能始于妊娠开始阶段直至妊娠结束胎盘娩出。研究调控胎盘滋养细胞生物学功能的因子,有利于进一步揭示子痫前期的发病机制。近年来,研究发现胎盘表达一系列的microRNA(miRNA or miR),在妊娠的不同时期胎盘有不同的miRNA表达谱,miRNA表达谱的异常改变可能与子痫前期的发病有关。miRNA是一类内源性的含有19-25核苷酸序列的小非编码单链核糖核酸,能够按照碱基互补配对的原则与靶基因3’端非编码(untranslated region,UTR)区特异性结合,在转录后水平抑制靶基因的翻译或促进靶基因降解,下调靶蛋白的产生,在胚胎发育、细胞代谢、肿瘤发生及免疫反应等方面发挥重要调控功能。miR-21在肿瘤及胎盘等多种组织中大量表达。在肿瘤微环境中,miR-21的表达明显上调,过表达的miR-21可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,被广泛认为是一种促癌miRNA。胎盘组织中miR-21下调与FGR的发生密切相关,低表达的miR-21可能降低胎盘滋养细胞增殖和侵袭。研究发现miR-3 1在人类的生育、胚胎生长、许多肿瘤及自身免疫疾病等方面发挥重要功能。Kresowik等发现与未孕相比,孕早期miR-31表达明显升高,孕早期表达上调的miR-31可能参与母胎间的免疫耐受过程,低表达的miR-31可能打破母胎之间的免疫耐受环境,导致流产等妊娠并发症的发生。尽管已有不少miRNA与子痫前期相关性的报道,但与细胞增殖、侵袭、血管生成及免疫耐受等功能密切相关的miR-21及miR-31在调控滋养细胞功能参与子痫前期发病方面尚无相关研究。采用生物信息学TargetSCAN、miRanda和miRDB分析数据库,我们找到miR-21和miR-31的共同靶基因RAS p21蛋白活化子1(RAS p21 GTPase activating protein1,RASA1)。RASA1是Ras蛋白三磷酸鸟苷酶激活蛋白(Ras GTPase activating protein,RAS-GAP)家族中的一员,在多种肿瘤组织中明显低表达,可激活内源性RAS p21 GTP酶,水解RAS GTP成RAS GDP,RAS p21蛋白随之失活,从而使具有抗凋亡和促进细胞生长功能的RAS-MAPK信号通路关闭。目前为止,尚无miR-21和miR-31靶向RASA1参与子痫前期发病之间的研究。本课题研究主要包括以下三个部分:一、miR-21和miR-31靶向调控RASA1参与子痫前期发病的研究二、miR-21和miR-31对滋养细胞生物学功能的调控作用三、血液循环中miR-21和miR-31对子痫前期发病的预测价值第一部分:miR-21和miR-31靶向调控RASA1参与子痫前期发病的研究研究目的:分别比较早发子痫前期、晚发子痫前期与各自孕周匹配的正常胎盘组织中miR-21、miR-31 及 RASA1 的表达差异,分析 miR-21 与 RASA1、miR-31 与 RASA1之间的相关性及靶向调控关系。材料方法:1.选取2017年01月至2018年03月在山东大学齐鲁医院及淄博市中心医院行剖宫产的孕妇共77例,其中早发子痫前期(early onset PE,EOPE)20例、同早发子痫前期孕周匹配的正常对照组1(Control 1)17例、晚发子痫前期(late onset PE,LOPE)20例、同晚发子痫前期孕周匹配的正常对照组2(Control 2)20例。2.采用stem-loop实时定量聚合酶链反应分析miR-21、miR-31在子痫前期胎盘及正常胎盘之间的表达差异。3.采用生物信息学分析找到miR-21、miR-31共同靶基因RASA1。首先免疫组化技术定位RASA1在胎盘组织的表达,实时定量聚合酶链反应及Western blot技术检测子痫前期与正常胎盘组织中RASA1的表达。采用Pearson相关系数分别分析miR-21与RASA1、miR-31与RASA1之间的相关性。4.在人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo中,采用脂质体转染mimics、inhibitors技术分别过表达和敲低miR-21、miR-31,验证转染效率,采用实时定量聚合酶链反应及Western blot技术检测RASA1表达的变化。构建人RASA1基因3’端UTR区野生型及突变型载体,采用双荧光素酶报告基因实验分别检测miR-21与RASA1、miR-31与RASA1之间是否存在直接靶向调控关系。研究结果:1.纳入研究的早发子痫前期、晚发子痫前期分别与各自孕周匹配的正常孕妇的临床资料相比,在年龄、分娩时孕周、初产妇数目以及新生儿性别之间均无明显统计学差异。子痫前期组的血压、体重指数(body mass index,BMI)及尿蛋白均明显高于相同孕周的正常妊娠组。早发子痫前期组的新生儿出生体重和胎盘重量与对照组1相比均无差异,而晚发子痫前期组的新生儿出生体重和胎盘重量均明显低于对照组2,差异有统计学意义。2.早发子痫前期组与正常对照组1相比,晚发子痫前期组与正常对照组2相比,miR-21和miR-31均明显低表达,差异有统计学意义。3.生物信息学分析结果显示miR-21和miR-31均存在与RASA1 mRNA的3’UTR区的结合位点。免疫组化技术显示RASA1在子痫前期及正常胎盘中均有表达,其免疫着色主要位于滋养细胞。早发子痫前期组与正常对照组1相比,晚发子痫前期组与正常对照组2相比,RASA1 mRNA及蛋白均明显高表达,差异有统计学意义。经两变量间Pearson相关性分析显示,miR-21和RASA1的表达呈负相关,miR-31和RASA1的表达亦呈负相关。4.在人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo中,分别转染miR-21、miR-31后均可以负向调控RASA1 mRNA和蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验结果提示野生型RASA1结合位点可以分别与miR-21、miR-31结合并使荧光素酶的活性明显减低,转染突变型的RASA1荧光素酶活性的差异消失,证实在人胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo 中 miR-21、miR-31 均可特异性结合到 RASA1 mRNA3’UTR 区。研究结论:1.胎盘组织中miR-21、miR-31低表达与子痫前期的发病有关。2.子痫前期患者胎盘组织中RASA1明显高表达,胎盘组织中miR-21、miR-31与RASA1的表达均呈负相关。3.在人胎盘滋养细胞中,miR-21、miR-31均可以负向调控RASA1的表达,miR-21、miR-31均可特异性结合到RASA1 mRNA 3’端UTR区,存在直接靶向调控关系。4.miR-21、miR-31可靶向调控RASA1而参与子痫前期的发病。第二部分:miR-21和miR-31对滋养细胞生物学功能的调控作用研究目的:在人滋养细胞HTR-8/SVneo中分别过表达和敲低miR-21、miR-31后,研究滋养细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡能力的改变,探讨miR-21、miR-31对滋养细胞生物学功能的调控作用。材料方法:1.在人滋养细胞 HTR-8/SVneo 中分别转染 miR-21、miR-31 的 mimic、mimic NC、inhibitor以及inhibitor NC后,验证转染效率。采用CCK-8实验检测转染后0、24、48、72h时滋养细胞的增殖能力。2.在人滋养细胞HTR-8/SVneo中分别过表达和敲低miR-21、miR-31后,首先利用划痕实验检测miR-21、miR-31对滋养细胞迁移能力的影响,利用Transwell迁移及侵袭实验进一步验证miR-21、miR-31对滋养细胞迁移和侵袭能力的影响。3.在人滋养细胞HTR-8/SVneo中分别过表达和敲低miR-21、miR-31后,利用流式细胞术分析滋养细胞凋亡能力的改变,利用Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达变化。研究结果:1.CCK-8实验表明:分别过表达和敲低miR-21、miR-31 24h时滋养细胞存活率均无明显改变;过表达miR-21 48h和72h时,滋养细胞存活率均明显增高;敲低miR-21 48h和72h时,滋养细胞存活率均明显降低;过表达miR-31 48h和72h时,滋养细胞存活率均明显增高,敲低miR-31 48h时,滋养细胞存活率明显降低,敲低miR-31 72h时,滋养细胞存活率的改变无明显统计学意义。2.划痕实验及Transwell迁移实验均表明,分别过表达miR-21、miR-31后滋养细胞的迁移能力均显著增强,分别敲低miR-21、miR-3 1后滋养细胞的迁移能力均显著下降。Transwell侵袭实验表明,分别高表达miR-21、miR-31后滋养细胞的侵袭能力均显著增强,分别敲低miR-21、miR-31后滋养细胞的侵袭能力均显著下降。3.流式细胞术及Western Blot技术表明,分别过表达miR-21、miR-31后滋养细胞的凋亡率均明显降低,Caspase-3表达均显著被抑制,Bcl-2表达均显著增加,同时Bax表达均显著被抑制;而分别敲低miR-21、miR-31后滋养细胞的凋亡率均升高,Caspase-3、Bcl-2及Bax表达的变化与过表达相反。研究结论:miR-21、miR-31均可以促进滋养细胞增殖、迁移及侵袭,可通过调控凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2及Bax抑制滋养细胞的凋亡。第三部分:血液循环中miR-21和miR-31对子痫前期发病的预测价值研究目的:通过分析未孕、子痫前期及其孕周匹配的正常妊娠妇女血浆中miR-21、miR-31的表达差异,探讨血液循环中miR-21、miR-31对子痫前期发病的预测价值。材料方法:采集2017年01月至2018年03月在山东大学齐鲁医院和淄博市中心医院就诊的育龄期妇女外周血血浆共90例,其中未孕10例、20-33+6周正常妊娠20例、早发子痫前期20例、3441周正常妊娠20例及晚发子痫前期20例。miRcute富集试剂盒提取外周血中的miRNA,采用stem-loop实时定量聚合酶链反应检测血浆中miR-21、miR-31,以未孕组作为对照,分析miR-21和miR-31在子痫前期和与其孕周匹配的正常孕妇的表达差异。此外,早发、晚发子痫前期的孕妇经过治疗于终止妊娠时再次采集其外周血血浆,检测miR-21、miR-31的表达水平,与其自身诊断子痫前期时的表达做比较。受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析miR-21、miR-31对子痫前期是否有预测价值。研究结果:1.各组研究对象在年龄、体重指数之间均无明显统计学差异。20-33+6周正常妊娠组和34-41周正常妊娠组在血压、分娩时孕周、分娩方式、新生儿性别、新生儿出生体重及胎盘重量方面无统计学差异。早发子痫前期组和晚发子痫前期组在血压、分娩方式及新生儿性别方面无统计学差异,而早发子痫前期组的24小时尿蛋白定量明显高于晚发子痫前期组,早发子痫前期组分娩时妊娠周数、新生儿出生体重和胎盘重量明显低于晚发子痫前期组,有统计学差异。2.miR-21、miR-31在未孕组、20-33+6周正常妊娠组、早发子痫前期组、34-41周正常妊娠组及晚发子痫前期组的血浆中均有表达。以未孕组作为对照,血浆中miR-21在早发子痫前期组与其孕周匹配的20-33+6周正常妊娠组相比差异无统计学意义;血浆中miR-21的表达在晚发子痫前期组与其孕周匹配的3441周正常妊娠组相比明显降低,有极显著统计学差异;34-41周正常妊娠组miR-21的表达较未孕组及20-33+6周正常妊娠组均明显升高。以未孕组作为对照,血浆中miR-31在早发子痫前期组与其孕周匹配20-33+6周正常妊娠组相比明显低表达;血浆中miR-31的表达在晚发子痫前期组与其孕周匹配的34-41周正常妊娠组相比差异无统计学意义;20-33+6周正常妊娠组miR-31的表达较未孕组及34-41周正常妊娠组均明显升高。此外,早发子痫前期组miR-21、miR-31的表达较晚发子痫前期组均明显降低。3.早发、晚发子痫前期组的孕妇终止妊娠时miR-21、miR-3 1的表达与其自身诊断子痫前期时的表达相比,差异均无统计学意义。4.ROC曲线分析结果显示:血浆中miR-21可以区别晚发子痫前期和其孕周匹配的正常妊娠,截断值为2.309,灵敏度为65.1%,特异度为90.3%;血浆中miR-31可以区别早发子痫前期和其孕周匹配的正常妊娠,截断值为0.947,灵敏度为95.0%,特异度为70.0%。研究结论:1.与相同孕周的正常妊娠相比,晚发子痫前期患者血浆中miR-21显著低表达,早发子痫前期患者血浆中miR-31显著低表达。2.早发子痫前期患者血浆中miR-21、miR-31的表达均明显低于晚发子痫前期患者。3.子痫前期患者无论早发还是晚发,其血浆中miR-21、miR-31的表达在诊断子痫前期时和终止妊娠时无差异。4.孕周不同,血浆miR-21、miR-31的表达也不同。在研究子痫前期时,应该考虑到孕周,子痫前期与其孕周匹配的正常妊娠相比较,才能得出更准确更科学的结论。5.ROC曲线分析显示血浆中miR-21对晚发子痫前期有较高的预测价值,miR-31对早发子痫前期有较高的预测价值。