论文部分内容阅读
薯蓣褪绿坏死花叶病毒（Yam chlorotic necrotic mosaic virus,YCNMV）是马铃薯Y病毒科（family Potyviridae）柘橙病毒属(genus 的一个暂定成员。该病毒是本课题组2009年在云南省永胜县的野生小花盾叶薯蓣上发现并命名的。由于该病毒当时只测定了 4个分离物的3’端序列（包括部分nib基因序列、完整cp基因和3’-UTR序列）,尚有诸多关键信息未被明确,其分类地位也还需大量的实验证据支持。为了进一步明确该病毒的分类地位,增加对YCNMV的认识,本研究开展了 YCNMV的全基因组序列测定、普通生物学特性和cp基因的分子遗传多样性研究,并建立了 YCNMV血清学和RT-PCR（Reverse transcription PCR）检测体系。同时,还构建了 T7启动子下的YCNMV的侵染性克隆,并初步完成了对部分YCNMV疑似运动蛋白的亚细胞定位。具体研究工作如下:（1）对YCNMV的普通生物学及基因组结构进行了初步研究YCNMV粒子呈曲线状,大小为600-700X 13 nm,具有典型Potyviridae科病毒风轮状内含体。利用RACE方法获得了 YCNMV的全基因组序列。基因组结构分析表明,YCNMV具有Potyviridae科成员中最小的基因组结构,其基因组序列全长8 208 nt（不含Poly A尾）;基因组包含一个大的ORF（由7 866 nt组成,编码2 621 aa）,编码9个功能基因,在p3基因内同样存在一个PIPO移动阅读框,但与Potyviridae科其它病毒相比缺乏p1基因结构域。在YCNMV基因组中未发现与蚜传相关的PTK、KITC和DAG保守基序。YCNMV与Macluravirus病毒属另外两个病毒:中国薯蓣坏死花叶病毒（Chinese yam necrotic mosaic virus,CYNMV）和菊芋潜隐病毒（Artichoke laten virus,ArLV）的全基因组核苷酸序列同源性为55.22-72.91%,ORF核苷酸序列同源性为56.08-73.09%,ORF氨基酸序列同源性为49.40-80.66%,cp基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为51.40-70.57%和40.72-70.24%。根据ICTV Potyviridae科cp基因或全基因组序列核苷酸低于76%,CP氨基酸序列同源性低于80%的分类标准,YCNMV应是Potyviridae科Macluravirus属的一个新成员。YCNMV与Potyviridae科其它属ORF核苷酸和氨基序列构建的系统进化树分析也表明,YCNMV明显的被归在Macluravirus属内,与CYNMV在同一簇内,但存在明显的进化分支。以磨擦、浸润接种等方法在多种常见宿主植物上开展的接种实验表明,所接种植物未能检测到YCNMV病毒。利用蚜虫接种后,在接种薯蓣和本生烟植株上也没有检测到YCNMV病毒。这些结果表明,YCNMV或具有相对狭窄的寄主范围,或以其他方式进行传播。以ID-ELISA法检测YCNMV与部分Potyviridae科病毒成员的血清学关系,结果表明YCNMV与所检测病毒不具有或仅有极弱的血清学反应,上述结果表明YCNMV与所检测的Potyviridae科其他病毒成员血清学关系较远。（2）建立了 YCNMV血清学检测体系和分子生物学检测体系成功构建了 YCNMV cp基因原核表达载体,将纯化后的CP重组蛋白免疫新西兰大白兔制备获得高效价的抗血清。利用该抗血清建立了 ID-ELISA、Dot-ELISA、Western blot等YCNMV特异性血清学检测体系。通过设计简并引物、特异检测引物及特异qPCR检测引物,建立了针对YCNMV的RT-PCR、qRT-PCR分子生物学检测体系。采用本研究建立的检测体系检测了从云南省境内多地采集的疑似感病薯蓣样品共计171株,并从中检出20株YCNMV分离物,获得了其3’端序列（包括部分nib基因、完整cp基因和3’-UTR序列）。上述结果表明,所构建的检测体系稳定且特异性好,可用于后续YCNMV检测。（3）开展了 YCNMV cp基因分子遗传多样性研究结合从NCBI上获得的部分Potyviridae科其他成员序列信息,以及测序获得的20株YCNMV分离物序列信息,对YCNMV进行了分子遗传多样性研究。cp基因、CP氨基酸和3’-UTR序列生物信息学分析表明,YCNMV具有丰富的遗传多样性,且多样性程度明显高于CYNMV。重组分析显示,YCNMV基因重组不明显,但YCNMV同时具有很高的核苷酸位点多态性（Pi）（0.16114±0.01333）及单倍型多态性（0.996±0.013）（Hd）,表明YCNMV分子遗传多样性程度相对较高。选择压力分析表明YCNMV总体处于强烈的净化选择压力（Purifiying selection）下（dN/dS=0.1257）,基因进化较保守,但依然从YCNMV不同分离物cp基因中检出4个疑似零散多向型选择位点,其中Codon273位点具有显著差异（p≤0.05）。（4）利用Infusion技术构建了 T7启动子下的YCNMV侵染性克隆构建了 YCNMV的全长侵染性克隆载体（pSKycnmv）,测序结果表明,该侵染性克隆序列正确,没有发生碱基的插入、缺失及重组等突变。但体外转录物磨擦接种本生烟、心叶烟7天及22天后RT-PCR暂未检测到YCNMV,其侵染性有待进一步确认。（5）检测了 4个YCNMV可能运动蛋白的亚细胞定位将YCNMV的4个疑似运动蛋白分别与GFP在本氏烟中融合表达后,利用共聚焦显微镜观察浸润叶片下表皮细胞。结果表明,HC-Pro,VPg及CP主要定位于细胞核及细胞质中,无明显趋向性分布。CI主要定位于细胞核及细胞壁/质膜上,并在细胞壁/质膜上呈现点刻状分布。据此推测,CI可能是YCNMV定位于胞间连丝上的主要运动蛋白之一。综上所述,以上工作为YCNMV分类地位的确定,深入理解YCNMV的种群遗传结构及YCNMV的侵染机制奠定了基础。