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研究背景：继预防性疫苗之后，伴随着免疫学、分子生物学和细胞生物学的不断深入发展，近年来治疗性疫苗发展迅速。通过重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力，治疗性疫苗可以在患病个体诱导特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。治疗性疫苗已经成为防治恶性肿瘤术后复发转移的重要技术手段。由于DNA疫苗具有抗原性特异、应用安全及生产便捷的显著优点，作为一种特殊的高技术生物治疗药物，多种类型的DNA疫苗已经进入了临床前期及临床试验。针对恶性肿瘤治疗中的核心难题―免疫耐受‖，基于自主研发的可复制型DNA疫苗载体系统，本课题组开展了治疗性疫苗的免疫增效策略研究，并成功构建了新型双质粒可复制型抗肿瘤DNA疫苗。我们选择在多种实体肿瘤中广泛表达的两种肿瘤抗原HCG和Survivin，并选择与肿瘤血管新生关系密切的靶点VEGFR2，利用异种化抗原设计技术，构建了抗肿瘤多靶点异种同源基因复合抗原，可以有效打破肿瘤对自身抗原的免疫耐受，激活高效的细胞免疫和体液免疫反应，从而提高肿瘤临床治愈率。研究目的：在实验室前期坚实的工作基础之上，构建由CAVA及CAVE组成的可复制型双质粒DNA疫苗，通过肌肉注射联合电脉冲的方法将得到的双质粒疫苗递送到小鼠体内，观察疫苗的抑瘤效果并对其可能的免疫学机制进行初步的探讨。方法：1.利用胰蛋白酶灌注消化法分离收集人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells, HUVEC)，进一步采用肿瘤细胞HepG2培养上清液诱导HUVEC向肿瘤源性内皮细胞(Tumor derived-Endothelial Cells, Td-EC)分化增殖。通过形态学观察和荧光标记Ⅷ因子相关抗原,鉴定血管内皮细胞；利用RT-PCR检测Td-EC中肿瘤血管内皮标志物(TEM)的表达。2.将小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域（mVEGFR2D1-4）及人β-hcg全长基因分别克隆到原核表达载体pET-42a中，将得到的原核表达质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中并通过IPTG诱导表达，亲和层析法纯化融合蛋白，经SDS-PAGE分析，Western blot鉴定纯化后的目的蛋白，ELISA法检测纯化蛋白的抗原活性。3.利用前期成功构建的质粒pVAX1-mVEGFR2-GFc-hIL12及可复制型载体系统PSVK，构建以异种化的mVEGFR2D1-4为靶抗原的可复制型DNA疫苗，命名为CAVE。4.将DNA疫苗CAVE与前期构建好的CAVA采用电穿孔肌肉内注射的方式免疫小鼠，观察DNA疫苗的抑瘤效果，并对其相关的免疫学机制进行初步的研究：采用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异抗体滴度和血清中的细胞因子的水平；采用ELISPOT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ的分泌；采用海藻酸盐包裹肿瘤细胞移植物评价抗血管生成情况；对肿瘤组织进行CD31免疫组化染色观察疫苗免疫后肿瘤毛细血管密度。结果：1.成功分离得到了HUVEC，并将其诱导成为具有良好生物学活性的具有肿瘤源内皮细胞特性的Td-EC。2.成功诱导并纯化出具有良好免疫原性的mVEGFR2D1-4/GST及人β-hcg/GST融合蛋白。3.成功构建了可复制型DNA疫苗CAVE，并通过Western Blot检测证实了其体外真核表达。4.观察联合应用与单独应用两种DNA疫苗免疫后的C57BL/6小鼠移植瘤生长趋势，发现与对照组相比疫苗免疫组小鼠肿瘤生长受到显著抑制，联合应用免疫组效果更为显著。疫苗免疫组小鼠血清内可检测到特异性抗Survivin、β-hcg及VEGFR2抗体，脾脏内可检测到特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞；海藻酸盐包裹肿瘤细胞移植物实验及肿瘤组织CD31免疫组化检测证实CAVE能够显著抑制肿瘤组织毛细血管生成。结论：本研究所构建的新型可复制型双质粒DNA疫苗与单独应用及对照组相比，在小鼠体内可以诱导产生更强的特异性细胞和体液免疫反应，能够抑制移植瘤的生长，为肿瘤的主动免疫治疗提供了一种新的选择。