葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae(Fitch)属于半翅目Hemiptera根瘤蚜科Phylloxeridae,是为害我国葡萄生产的重要检疫性害虫,其幼虫和成虫均可吸取寄主植物汁液,形成叶瘿和根瘤。目前在我国主要以根瘤型危害为主,危害发生时可造成葡萄根系腐烂,严重时甚至死亡。对于生活在土壤中的葡萄根瘤蚜,嗅觉在其寻找和定位寄主过程中发挥着重要作用,而嗅觉相关蛋白参与昆虫外围嗅觉活动,是昆虫嗅觉活动的分子基础。因此,对葡萄根瘤蚜嗅觉相关蛋白基因进行鉴定和功能解析有助于掌握昆虫嗅觉识别的分子机制,也可为进一步研究害虫嗅觉干扰和生物防治提供理论依据。本研究通过分析葡萄根瘤蚜转录组,鉴定获得了27个葡萄根瘤蚜嗅觉相关基因,并对其进行了序列分析和基因克隆。并在此基础上对葡萄根瘤蚜头部高表达的气味结合蛋白和化学感受蛋白进行了原核表达、蛋白纯化、荧光竞争结合和免疫荧光定位研究,得到主要研究结果如下:1、葡萄根瘤蚜触角、口器超微结构观察及感器鉴定为了揭示嗅觉相关蛋白在感器中的定位,通过扫描电镜对该虫触角和口器超微结构进行观察,结果显示:触角柄节着生2个毛形感器,梗节着生2个毛形感器和一个钟形感器,鞭节着生7个毛形感器(端部5个,近端部2个)和1个原生感觉圈,其中原生感觉圈内着生1个大型板形感器和4个腔锥形感器。口器上唇具3个毛形感器,下唇分为4节,腹面有一条纵向的下唇沟,下唇沟两侧对称分布10对毛形感器,下唇端部分布有6对锥形感器,口针束由1对上颚口针和1对下颚口针嵌合组成,下颚口针外表面光滑,内表面有食物道和唾液道,在端部愈合形成共同通道。2、葡萄根瘤蚜嗅觉相关基因鉴定通过分析葡萄根瘤蚜转录组,鉴定获得了27个嗅觉相关基因,分别为7个OBPs、7个CSPs、4个ORs、1个SNMPs以及8个GSTs。其中DviOBPs氨基酸序列包括6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,分别属于传统OBPs和Plus-C OBPs家族;DviCSPs包括4个保守的半胱氨酸残基,形成2对二硫键,对蛋白形成特定空间结构有重要作用;DviORs中的DviORco和DviOR12均含有7个跨膜区域,DviOR19和DviOR43含有6个跨膜区域;DviSNMP1氨基酸序列的两端各含有1个跨膜区域;鉴定获得8个DviGSTs,包括7个胞质体GSTs和一个微粒体GSTs,其中7个胞质体GSTs分别为DviGSTd1、DviGSTd2、DviGSTt1、DviGSTo1、DviGSTs1、DviGSTs2和DviGSTs3,分属于四个不同的家族,即Delta、Theta、Omega和Sigma,1个微粒体GSTs为DviGSTm,包含三个跨膜区域和一段保守的序列。根据已获得的葡萄根瘤蚜27个不同家族嗅觉基因分别与其它昆虫相应家族基因构建系统发育树,结果表明葡萄根瘤蚜各家族基因与其它昆虫相应家族基因均有较近亲缘关系。通过sRT-PCR技术研究各基因在不同组织中的分布情况,结果显示DviOBP1在头部有特异性的表达,DviOBP6、DviOBP7和DviSNMP1在头部的表达比在身体中多,而DviOBP2、DviGSTo1和DviGSTs1在身体中的表达比在头部多,其它基因在头部和身体的表达无明显差异。3、葡萄根瘤蚜外围嗅觉系统的结合底物测定通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)采用固相微萃取技术(SPME)对寄主植物中的易感品种巨峰葡萄根系挥发物进行测定,筛选获得包括醛类(5种)、萜烯类(14种)、醇类(12种)、烷类(11种)、酯类(5种)和其它(4种)共51种挥发物。4、葡萄根瘤蚜嗅觉相关基因的原核表达与纯化通过质粒提取、双酶切、连接和转化等技术构建了重组表达质粒pET-28a(+)/DviOBP1、pET-28a(+)/DviOBP3、pET-28a(+)/DviOBP6、pET-28a(+)/DviCSP2和pET-28a(+)/DviCSP5,经IPTG诱导表达及Ni柱纯化,最终获得了可溶性目的蛋白DviCSP2和DviCSP5,采用Bradford蛋白浓度测定法测定纯化后的目的蛋白浓度,分别为17.53μM和20.22μM。5、葡萄根瘤蚜化学感受蛋白与底物的竞争结合能力测定选取19种葡萄根系挥发物为配基,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白DviCSP2和DviCSP5的结合能力,结果表明:DviCSP2可与亚油酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、桉油精和莰烯结合,结合常数分别为168.40、222.19、351.94和349.00μM;DviCSP5除可与亚油酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、桉油精和莰烯结合外,还可与己醛、芳樟醇、异辛醇和苯甲醇结合,结合常数分别为27.36、21.57、22.62、70.04、91.06、14.44、72.52和81.72μM。DviCSP2和DviCSP5对葡萄根瘤蚜识别酯类物质有重要作用,且DviCSP5与配基的结合能力更强。6、葡萄根瘤蚜化学感受蛋白DviCSP5的免疫荧光定位测定将纯化得到的DviCSP5蛋白免疫新西兰大白兔并成功制备多克隆抗体,对DviCSP5在葡萄根瘤蚜各组织中分布进行整体免疫荧光定位,结果表明:在触角感器中无明显的荧光标记,口器第三和第四节中的毛形感器被标记,中足端部也有明显的荧光标记,但非感器。化学感受蛋白DviCSP5主要分布于葡萄根瘤蚜口器感器和中足端部淋巴液中,但在触角感器中无明显的分布。