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研究背景:大量研究表明,气道上皮的修复存在多种机制,包括肺外干细胞（骨髓、外周血、胚胎等来源）和肺内干细胞,但是肺外干细胞对气道上皮修复的贡献远不及肺内干细胞。气道上皮黏膜存在具有自我更新能力的干细胞,这群干细胞能够有效修复损伤的气道上皮。1995年Stripp等首次发现,Naphthalene损伤气道上皮后,气道末端（接近肺泡的部位）有少量被称为vClub（过去被称为vClara细胞）的细胞存活下来,这群存活下来的细胞能够修复损伤的气道上皮。经鉴定,这些气道上皮干细胞表达分泌珠蛋白家族成员1A1（Secretoglobin family 1A member1,Scgb1a1）。利用CreER-flox转基因策略把表达Scgb1a1的干细胞特异性标记上EGFP,通过体内和体外实验证实了Scgb1a1阳性表达的vClub气道干细胞能够分化成Club细胞（过去被称为Clara细胞）。哮喘患者气道上皮受损后得不到及时修复是否与气道干细胞分化功能低下有关,需要进一步实验研究证实。细胞自噬的相关功能在哮喘病生理中的作用正在逐步被揭示。相关研究证明,儿童哮喘与细胞自噬相关基因5（Autophagy related 5,Atg5）的变异直接相关。急性哮喘气道上皮受损得不到及时修复会引发向慢性哮喘的转变。同时大量的研究证明自噬与葡萄糖之间存在联系,低糖促进细胞自噬,细胞自噬是否也反馈调节气道干细胞糖摄取功能,进而影响气道干细胞增殖与分化功能,最终影响气道上皮损伤后的修复过程,是否进而影响急性哮喘向慢性哮喘的转化,我们将就这些问题进行研究。研究方法:1.利用Atg5f/f小鼠和Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠进行急性哮喘造模;利用CYTO-ID autophagy detection kit检测Atg5f/f小鼠急性哮喘造模（OVA造模）后vClub细胞中自噬变化情况;利用流式分析仪分析急性哮喘造模后Atg5f/f和Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠气道上皮的vClub细胞中丰度的变化的情况。2.利用流式细胞分选仪分选野生型小鼠的vClub细胞,进行体外类器官培养,培养条件包括自噬激活剂（Spermidine）、自噬抑制剂（3-MA,Bafilomycin）。利用条件性基因敲除小鼠Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠分选vClub细胞,用野生型小鼠作对照组,在体外进行类器官培养,研究细胞自噬对vClub细胞增殖和分化功能的影响。同时利用Atg5f/f小鼠和Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠进行Naphthalene肺损伤造模,造模期间每天监测小鼠体重变化,分析对照组和实验组小鼠的体重变化;在D0、D2、D20收取小鼠肺组织,利用肺组织免疫荧光染色（Cyp2f2）,分析vClub细胞的体内分化情况。3.利用2-NBDG荧光检测vClub细胞葡萄糖摄取的能力,2-NBDG是荧光标记的葡萄糖类似物,能够检测vClub细胞葡萄糖摄取的情况,利用Atg5f/f小鼠和Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠分选vClub细胞,体外孵育1小时,采用流式分析实验组和对照组中vClub细胞显示GFP阳性细胞的比例。4.利用流式细胞分选仪分选野生型小鼠的vClub细胞,进行体外类器官培养,培养条件是不同浓度的葡萄糖（4.5g/L、1.5g/L、0.5g/L和0g/L）和糖酵解通路抑制剂2-DG。利用条件性基因敲除小鼠Scgb1a1-creER;Glut1 f/f小鼠分选vClub细胞,用野生型小鼠作对照组,在体外进行类器官培养,研究葡萄糖对vClub细胞增殖和分化功能的影响研究结果:1.急性哮喘造模后,分选小鼠气道上皮vClub干细胞,采用CYTO-ID autophagy detection kit分析PBS组和OVA组CAT+细胞所占比例,发现急性哮喘造模后CAT+vClub细胞减少,自噬水平下降。此外,Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠在急性哮喘造模后,vClub细胞在小鼠肺中的丰度和对照组相比明显下降,表明自噬有利于维持小鼠肺中vClub细胞的丰度。气道干细胞缺失Atg5对卵清蛋白诱导的炎症细胞的招募没有影响。2.利用流式分选获得vClub细胞,类器官培养发现自噬激活剂（Spermidine）促进vClub细胞的增殖和分化,自噬抑制剂（3-MA,Bafilomycin）抑制vClub细胞的增殖和分化,利用条件性基因敲除小鼠Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠分选vClub细胞,体外类器官培养,发现Atg5缺失抑制vClub细胞的增殖。利用Naphthalene肺损伤模型,分析对照组Atg5f/f小鼠和实验组Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠体重变化,实验组D2的体重下降比率明显高于对照组,分析对照组和实验组D20的体重变化,发现实验组体重恢复速率明显小于对照组;利用小鼠肺组织免疫荧光染色（Cyp2f2）,分析D0、D2和D20肺上皮气道中Cyp2f2阳性细胞数量,发现实验组的vClub的分化明显低于对照组的分化。3.利用Atg5f/f小鼠和Scgb1a1-creER;Atg5f/f小鼠中提取vClub细胞,采用2-NBDG荧光法分析自噬对vClub细胞摄取葡萄糖能力的影响。结果显示,敲除Atg5基因vClub细胞摄取葡萄糖能力下降。4.通过vClub细胞类器官培养发现,低糖（0.5g/L）促进vClub细胞的增殖,但对vClub细胞分化没有太大影响,无糖（0g/L）抑制vClub细胞的增殖和分化的功能;加入糖酵解途径抑制剂2-DG,抑制vClub细胞的增殖,促进分化。研究结论:细胞自噬促进气道干细胞的增殖和分化功能。卵清蛋白诱导急性哮喘造模后,小鼠气道干细胞自噬水平下降,丰度减少。自噬促进了气道干细胞对葡萄糖的摄取,而葡萄糖剥夺、抑制糖酵解和Glut1缺失抑制气道干细胞的增殖。虽然阻断气道干细胞自噬不影响卵清蛋白诱导的急性哮喘炎症反应,细胞自噬通过葡萄糖代谢的重编程维持气道干细胞的再生功能,一定程度上可缓解哮喘急性炎症反应向慢性炎症过程转变。