烟草(NicotianatabacumL.)，茄科(Soalnaceae)、烟属(Nicotiana)，主要起源于美洲、大洋洲及南太平洋的一些岛屿，大约在明朝万历年间(1573～1619年)传入我国，目前发现的烟属植物有66种。烟草是喜温作物，1～2℃低温时植株即死亡，10～13℃生长停止。在成熟期昼夜平均在16～17℃以下，叶片品质低劣。因此，低温寒害是影响烟草生产的重要限制因子，严重的影响其产量和品质。 本实验将低温诱导启动子RD29a控制的GUS基因转入烟草，以探明拟南芥RD29a启动子在烟草植株中的表达特性；同时，将该启动子分别控制的拟南芥CBF3低温应答转录激活因子基因和COR15a冷诱导基因一起转入烟草，以期利用CBF3的快速和高效激活所有携带CRT/DRE元件的冷诱导基因表达，以及COR15a抗寒基因对光合膜等内膜系统的强力保护，达到提高烟草植株的整体抗寒性和低温下的光合作用能力的目的。我们期望这种抗寒改良策略在模式植物烟草上的成功，以便为其他经济作物的抗寒性改良提供理论和实践依据。主要研究结果如下： 1.分别将RD29a-GUS基因和RD29a-CBF3与RD29a-COR15a双价基因导入烟草材料K326中，PCR扩增检测结果表明有阳性扩增条带，初步证明外源基因已经整合到烟草基因组中。 2.转RD29a-GUS基因植株作GUS组织化学染色实验，结果表明，RD29a启动子在烟草中同在拟南芥中一样，不具有组织表达特异性，而是低温诱导型启动子。它在25℃常温下不表达，10℃左右为诱导临界温度，4℃左右稳定和高效表达。 3.转RD29a-CBF3和RD29a-COR15a双价基因植株的低温抗寒性实验结果显示，转基因植株在1℃48h未出现萎蔫，冰点温度-2℃，而非转基因植株1℃12h即出现萎蔫状态，冰点温度-1℃。电导率测定和用Logistic方程拟合，得到转基因植株LT50为-1.01℃左右，非转基因植株LT50为0.86℃。转基因植株的细胞膜伤害率比非转基因植株低20﹪，半致死温度低约1.87℃。转基因植株的POD活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量分别是非转基因植株的3.42倍、2.57倍、1.23倍。 4.正常温度下，转RD29a-CBF3和RD29a-COR15a双价基因植株生长状况与非转基因植株相似。但田间越冬栽植结果显示，转基因植株在抗寒性增强的同时，在植株形态上也发生了变化，主要特征有叶由长椭圆形变成柳叶状、茎秆变细，易折断、植株由高大直立变矮化、从生枝也增多、腋芽变得明显等；当温度回升后，植株的生长也基本恢复正常，这说明以RD29a为启动子的COR15a和CBF3基因的表达不会对转基因植物造成不正常生长的影响。 5.通过对转RD29a-CBF3和RD29a-COR15a双价基因植株三个株系T1代种子进行Kan抗性萌发，结果为100∶27、100∶35和100∶23，均倾向于3∶1，表明该基因在T1代中的分离规律符合孟德尔遗传规律，可能是单拷贝整合到烟草基因组中的。 6.转RD29a-CBF3和RD29a-COR15a双价基因植株保卫细胞叶绿体形态、分布密度和数目观察，可以明显地看到转基因植株保卫细胞呈圆形，非转基因植株保卫细胞呈椭圆形，在低温处理下，非转基因植株保卫细胞由椭圆形变为圆形，但在叶绿体形态、分布密度和数目上没有大的差别，均集中在22～28个之间。