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转座子(Transposon, Tn),是在生物界广泛分布的,能够在基因组上自主复制和转移的一段DNA序列。转座子能够有效介导基因转移,在转基因和基因捕获等研究中具有很高的应用价值。目前已经分离到很多高活性DNA转座子,如PiggyBac(PB)转座子Sleeping beauty (SB)转座子和Tol2转座子等,并已经在斑马鱼、小鼠、线虫等模式生物的转基因和基因捕获等研究中得到广泛应用,但目前对PB、SB和Tol2转座子在斑马鱼中的转座特性仍然缺乏深入了解。本研究系统比较了目前研究应用最为广泛的PB、SB和Tol2三种DNA转座子在斑马鱼中的基因转移和基因捕获效率差异,为转座子在相关领域的研究和应用提供参考。本实验主要包括：1、为比较PB、SB、Tol2转座子的基因转移效率差异,将含有鲤鱼的beta-actin启动子(命名为FAG)和绿色荧光蛋白报告基因(Green Fluorecent Protein, GFP)表达盒(FAG-GFP)分别克隆至PB、SB、Tol2转座子框架内,构建成pPB-FAG-GFP、pSB-FAG-GFP、 pTo12-FAG-GFP转基因载体。然后将3个载体分别与SB,PB及Tol2转座酶mRNA按照5个质量比20ng：10ng,20ng：30ng,20ng：50ng,20ng：80ng,20ng：100ng注射斑马鱼胚胎,获得3个转座子和转座酶最佳注射质量比例。其中SB和PB为20ng：50ng,Tol2为20ng：30ng。再以最佳注射比例注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测的斑马鱼FO代胚胎的GFP阳性率,结果表明：48hpf和120hpf检测的斑马鱼胚胎中,Tol2的GFP阳性分别为68%和68%(N=872),高于PB(66%和68%,N=885)和SB(64%和65%,N=897),但三者差异不显著(P>0.05)；FO代GFP阳性个体饲养至成年后与野生型个体交配获得F1代,对F1代的GFP检测表明：Tol2组的生殖系传递效率最高为46.07%(NF0=231),高于PB组的17.86%(NF0=212)和SB组的13.41%(NF0=199)。2、为比较PB、SB、Tol2转座子的增强子捕获效率差异,将含有斑马鱼krt4基因的基础启动子和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的表达盒(Krt4-GFP)分别克隆至3个转座子框架中,构建成：pPB-Krt4-GFP、 pSB-Krt4-GFP、 pTo12-Krt4-GFP增强子捕获载体。将3个载体分别与SB,PB及Tol2转座酶mRNA,按照上文优化的最佳比例注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测斑马鱼F0代胚胎的GFP阳性率,结果表明：Tol2组增强子捕获效率最高,48hpf和120hpf时分别为90.45%和92.71%(N=1524),显著高于PB组(83.18%和83.32%,N=1276),Tol2组在48hpf高于SB组(88.64%,N=1378),但差异不显著(P>0.05),在120hpf时显著高于SB组(88.87%,N=1378)(P<0.05)。FO代GFP阳性个体饲养至成年后与野生型个体交配获得F1代,对F1代的GFP检测表明：Tol2组生殖系传递效率最高达到55.56%(NF0=165),高于PB组的32.56%(NF0=149)和SB组38.36%(NF0=151)；F1代斑马鱼表达模式分布分析表明：To12能产生最多的单个表达模式的后代,PB则能产生更多表达模式的后代,SB趋于两者之间。3、为比较内部核糖体插入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)元件对转座子介导的基因捕获效率的影响,将IRES元件插入pTo12-RG-Trap基因捕获载体的PolyA捕获构件的下游,构建成pTo12-GTrap。以不含IRES元件的pTo12-RG-Trap基因捕获载体为对照,分别将pTo12-GTrap和pTo12-RG-Trap两个载体与Tol2转座酶mRNA,注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测斑马鱼FO代胚胎的GFP阳性率,结果表明：pTo12-GTrap组在48hpf和120hpf的胚胎GFP阳性率分别为74.93%和73.91%(N=986),显著高于pTo12-RG-Trap组(41.86%和41.04%,N=853)(P<0.05)表明IRES元件能够提高基因捕获效率。4、为比较PB、SB、Tol2转座子的基因捕获效率差异,以构建成pTo12-GTrap为基础,分别用PB和SB转座子框架替换Tol2框架,构建成pPB-GTrap和pSB-GTrap.将3个载体分别与SB,PB及Tol2转座酶mRNA,按照最优比例注射斑马鱼胚胎,分别在48hpf和120hpf检测斑马鱼F0代胚胎的GFP阳性率,结果表明：Tol2组基因捕获效率最高(74.93%和73.91%,N=986),显著高于SB组(66.07%和64.02%,N=1025)和PB组(54.23%和53.26%,N=976),且SB和PB之间差异也达到显著水平(P<0.05)。综上所述,本研究表明：在斑马鱼中,TYol2转座子的基因转移效率、增强子捕获效率、基因捕获效率和生殖系传递效率最高,IRES元件可以增强转座子介导的基因捕获效率,但在增强子捕获研究中,虽然Tol2转座子能够获得更多的增强子捕获个体,而PB能够获得较多的表达模式,在增强子捕获研究中可能具有更高的应用价值。