背景：自身免疫疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。系统性红斑狼疮和银屑病均为自身免疫性疾病,前者可累及全身多系统,而后者主要累及皮肤。慢性皮肤感染主要为细菌、病毒、真菌感染引起的以皮肤黏膜病变为主的一类疾病。调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)是能够抑制免疫反应的细胞群,在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面发挥重要的作用。调节性T细胞功能失调与人类多种重大疾病,如自身免疫性疾病、感染性疾病、过敏性疾病、恶性肿瘤、移植排斥的发生、发展及治疗都密切相关。FOXP3是叉状头转录因子家族中的一个成员,它是调节性T细胞(Treg)的标志性分子。FOXP3基因突变能引起严重的自身免疫性疾病,因此Foxp3在调节机体免疫自稳中起关键作用。FOXP3作为一个转录调控因子,通过直接调控多种基因来调节Treg的活性。表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化(DNA methylation),基因组印记(genomic impriting),母体效应(maternal effects),基因沉默(gene silencing),核仁显性,休眠转座子激活和RNA编辑(RNA editing)等。FOXP3基因中TSDR是一段高度保守的富含CpG位点的区域,在自然Treg中这段区域是完全去甲基化,但非Treg T细胞中则是完全甲基化的。高分辨率熔解(High-resolution melting,简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析,就能检测PCR片段的微小序列差异,从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个万面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。目前国内外尚无关于采用高分辨率溶解曲线分析技术检测上述疾病foxp3基因TSDR区域甲基化状态的相关资料。目的：此研究采用高分辨率溶解曲线分析技术检测自身免疫病与慢性感染患者foxp3基因TSDR区域甲基化状态,以探讨FOXP3基因TSDR区域甲基化对天然调节性T细胞的影响,同时观察FOXP3基因TSDR甲基化水平与系统性红斑狼疮疾病活动性的相关性。方法：从65例系统性红斑狼疮(包括狼疮活动期与非活动期患者)、30例银屑病、30例慢性皮肤感染(痤疮、甲真菌病、生殖器疱疹和单纯疱疹)患者以及23例健康人中抽取静脉血200ul,提取基因组DNA,重亚硫酸盐处理未发生甲基化的胞嘧啶,然后在rotor gene-6000仪器上进行高分辨率溶解曲线-PCR以检测溶解温度。结果：与其它各组比较,活动期SLE患者溶解温度最高(溶解温度越高代表甲基化水平越高,反之亦然),且有统计学意义(79.00±0.28vs其它组,p<0.001).与非活动性SLE组比较,银屑病组溶解温度较高,且有统计学意义(78.62+0.20vs78.49±0.29,p<0.05)；与健康组比较,银屑病组溶解温度较高,且有统计学意义(78.62±0.20vs78.44±0.25,p<0.01)。非活动性SLE与健康人比较,溶解温度无明显统计学意义(78.49±0.29vs78.44±0.25,p=0.464)。SLE活动性与溶解温度呈明显正相关。另外,慢性感染组与健康组比较,溶解温度更低,具有统计学差异(78.28±0.21vs78.44±0.25,p<0.05)。讨论：Foxp3是Treg发育过程中的主要调控者,其表达直接影响体内Treg水平。因此,Foxp3的高表达与体内Treg的高水平相关,反之亦然。Foxp3基因中TSDR是一段高度保守的富含CpG位点的区域,在自然Treg中这段区域是完全去甲基化,但非Treg T细胞中则是完全甲基化的。TSDR的去甲基化与foxp3的稳定表达相关,而TSDR的甲基化则可以降低foxp3的转录活性。现已证实通过PCR及其他DNA甲基化分析方法来检测foxp3中TSDR甲基化状态是一种能监测和定量外周血及组织中Treg含量的可靠方法。Foxp3中TSDR处于非甲基化状态时,能够通过结合转录因子如CREB和ATF,进而促进启动子活性。另外,通过比较Treg及非Treg T细胞中foxp3TSDR组蛋白H3、H4乙酰化水平发现组蛋白H3、H4乙酰化使foxp3稳定表达。在此研究中,我们通过运用HRM-PCR法,以自身免疫性疾病患者及慢性皮肤微生物感染患者为研究对象,分析其外周血分离的全基因组DNA中foxp3TSDR甲基化水平。研究结果发现,活动性SLE患者及银屑病患者的foxp3TSDR甲基化水平明显高于正常对照及非活动性SLE患者。在之前的一些研究中已经证实活动性SLE患者及银屑病患者体内foxp3TSDR的高甲基化能导致foxp3表达降低进而降低外周血中Treg水平。与此同时,我们的研究发现foxp3TSDR的甲基化水平在活动性SLE患者和银屑病患者之间也有明显的差异,具体表现为活动性SLE患者的溶解温度更高,进而甲基化程度更高。我们也发现在SLE患者中,疾病的活动度和严重程度直接与foxp3TSDR的甲基化水平相关。另一方面,我们发现慢性皮肤微生物感染患者的溶解温度与正常对照相比降低,表示其foxp3TSDR甲基化水平降低。持续的皮肤微生物感染能使更多的foxp3TSDR去甲基化,促进foxp3的表达,导致外周血中nTreg升高进而抑制正常的抗感染免疫反应。我们的发现与前期其他在银屑病,SLE,痤疮,真菌感染或慢性HSV感染中关于foxp3, foxp3TSDR,和／或Tregs研究的结果是一致的。据我们所知,我们的研究是第一次同时在自身免疫性疾病和慢性皮肤微生物感染中分析foxp3TSDR甲基化水平。结论：本实验得出结论：外周血Foxp3基因TSDR甲基化状态可以做为自身免疫病与感染性疾病的标记物。Foxp3基因TSDR甲基化水平在不同的疾病以及疾病的不同的阶段其表达水平不同,因此,通过检测Foxp3基因TSDR甲基化水平,可以预测疾病的进展、预后以及判断疾病的亚型。通过本次实验,我们发现表观遗传机制在调节性T细胞中的重要性。另外,Foxp3基因TSDR甲基化水平还可用来监测自身免疫性疾病疗效观察。纠正Foxp3基因甲基化水平可以增加调节性T细胞的免疫抑制作用以达到治疗疾病的作用。我们的实验证实,活动性系统性红斑狼疮患者Foxp3基因TSDR甲基化水平升高的程度较银屑病等其它疾病更显著,并经治疗后活动期SLE转变为非活动期其Foxp3基因TSDR甲基化水平降低,调节性T细胞增多。因此对于活动期SLE以及慢性感染而言,Foxp3基因TSDR甲基化水平是一项敏感且特异强的指标。Foxp3基因甲基化状态的研究在自身免疫病、慢性感染、肿瘤的研究还需继续深入,特别是不同甲基化位点,不同甲基化检测方法的分析。我们的研究得出结论高分辨率溶解曲线-PCR检测全血样本foxp3基因TSDR甲基化以预测调节性T细胞水平方法简便可靠。