【摘 要】
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在前人的研究中发现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH,EC1.1.1.49）在低温胁迫过程中可能有着重要作用。本试验以草莓’丰香’（Fragaria×ananassa cv.Toyonaka）和’红颜’（Fragaria×ananassa cv.Benihoppe）为材料,通过同源克隆得到草莓G6PDH家族5个基因并进行分析。接着
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在前人的研究中发现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH,EC1.1.1.49）在低温胁迫过程中可能有着重要作用。本试验以草莓’丰香’（Fragaria×ananassa cv.Toyonaka）和’红颜’（Fragaria×ananassa cv.Benihoppe）为材料,通过同源克隆得到草莓G6PDH家族5个基因并进行分析。接着用GLUCM（氨基葡萄糖）抑制G6PDH活性,对比低温处理的材料与正常温度生长的材料受到胁迫的程度。再利用Real-Time PCR技术筛选出低温下响应最明显的1个基因,分析其启动子中是否有和响应低温有关的元件。构建该基因的过表达和沉默载体在草莓果实中进行瞬时表达,分析低温处理前后相关基因和指标的变化,对FaG6PDH在草莓低温胁迫中的作用进行研究。主要结果如下:1.克隆得到FaG6PDH-P1.1基因全长编码序列（Full Coding Sequences,CDS）1752bp和FaG6PDH-PO基因全长编码序列1881bp,结合实验室前期得到的其他G6PDH序列,组成草莓的G6PDH家族。该基因家族的氨基酸数量在513-626之间,分子量在58.5-70.8k Da范围内。构建系统发育树后发现有1个属于胞质类型的基因:FaG6PDH-CY,2个质体P1类型基因:FaG6PDH-P1、FaG6PDH-P1.1,1个质体P2类型基因:FaG6PDH-P2,还有1个质体PO类型基因:FaG6PDH-PO。利用Real-Time PCR技术进行时空分析,发现各组织中胞质类型的FaG6PDH-CY表达量明显高于质体类型,且在根中表达量最高;在果实不同发育时期中也是FaG6PDH-CY表达量显著高于质体类型。2.当G6PDH活性被GLUCM抑制后,低温处理草莓会使其相对电导率、丙二醛等膜脂过氧化物含量增加,抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性降低,让植物受到更严重的伤害,但脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等渗透调节物质变化不明显,不影响细胞保水能力。3.利用Real-Time PCR技术分析草莓G6PDH家族基因在不同低温处理时间下的表达量变化。FaG6PDH-P1、FaG6PDH-P1.1和FaG6PDH-PO几乎无变化,FaG6PDH-P2变化不明显,最后筛选出FaG6PDH-CY为最响应低温胁迫的基因。4.克隆得到1015bp的FaG6PDH-CY启动子序列,在启动子的顺时作用元件里有一个响应低温的LTR,构建带有GUS基因的载体后注射烟草,通过GUS活性来验证启动子作用,发现该元件能响应低温诱导,从而驱动FaG6PDH-CY转录水平提高大量表达。5.构建过表达载体p CAMBIA1301-G6PDH-CY和沉默载体TRV2-G6PDH-CY,分别成功地在草莓离体果实上进行了瞬时表达,相关指标显示,低温胁迫下过量的FaG6PDH-CY能减轻草莓的受胁迫程度,减少FaG6PDH-CY的表达则会让草莓受胁迫的程度加深,相关基因表明FaG6PDH-CY可能是通过影响Fa Cu-Zn SOD、Fa CAT、Fac APX和Fa GR这几个抗氧化酶来参与草莓的低温响应。
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