谷胱甘肽(GSH)是植物体内一种重要的抗氧化剂,是维持细胞内氧化还原平衡的关键。GSH的活性基团巯基是它可以与一些药物、毒素等结合,具有解毒功能的原因。同时,GSH在还原硫的存储和运输,蛋白质和核酸的合成以及酶活性的调节方面也起到了关键作用。研究表明,GSH参与了植物抗生物胁迫(真菌,细菌,病毒)和非生物胁迫(盐胁迫,干旱胁迫,高温胁迫,氧化胁迫等)的过程。然而GSH如何调控植物系统性抗性来响应病毒侵染的分子机制还不清楚。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(NbECS)和谷胱甘肽合成酶基因(NbGS)是GSH合成途径中的两个关键酶基因。首先,我们从本氏烟中克隆出了NbECS和NbGS的全长序列。系统进化树的结果表明NbECS与烟草NtGSH1、番茄SlGSH1亲缘关系最近,NbGS与NtGSH2、SlGSH2亲缘关系最近。生物信息学分析显示NbECS基因编码的522个氨基酸中,Leu和Gly含量较高,NbGS基因编码的375个氨基酸中,Leu和Ser含量较高。NbECS蛋白据推测是一个稳定的亲水蛋白,而NbGS蛋白则是个不稳定亲水蛋白。NbECS和NbGS都没有信号肽,也不跨膜。NbECS相NbGS氨基酸序列的磷酸化位点都很多,尤其是Ser位点。Ser位点多是激活蛋白质活力的保障,主要是指酶活力,这个结果与NbECS和NbGS基因是酶的关键基因一致。NbECS和NbGS蛋白中都含有较多的α螺旋和无规则卷曲。NbECS蛋白是一个单体结构的蛋白,整个结构近似球状,边由许多螺旋区组成,起到催化作用的残基在整个结构的中央,通过球上内凹的空穴与其它氨基酸结合。NbGS蛋白的是一个同源二聚体,有A链和B链,起到催化作用的活性残基与其它物种中的同源基因在序列和结构上都非常相似。为了进一步研究GSH调控系统性抗性防御烟草花叶病毒(TMV)侵染的分子机制,我们进行了一系列的实验。首先,我们检测了被TMV侵染的本氏烟体内NbECS和NbGS基因的表达和GSH的含量。qRT-PCR结果表明TMV侵染诱导这两个基因的表达,同时GSH含量也显著上升。接着,通过外施GSH和OTC(L-2-噻唑林二酮-4-甲酸,GSH合成促进剂),GSH含量的增多导致TMV诱导的活性氧(ROS)积累减少,电导率下降,丙二醛(MDA)含量降低,TMV病毒的积累量也显著降低。而外施BSO(丁硫氨酸亚砜亚胺,GSH合成抑制剂)使GSH含量降低,增加TMV诱导的氧化损伤,同时TMV病毒积累量显著上升。接下来,我们通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)分别沉默本氏烟中的NbECS和NbGS以降低GSH的含量,结果发现TMV诱导的ROS积累增多,电导率升高,MDA含量变多,TMV病毒的积累量也显著上调。我们还通过农杆菌介导的瞬时过量表达技术在本氏烟中过量表达NbECS,GSH水平升高,同样TMV诱导的ROS积累变少,电导率降低,MDA含量降低,TMV病毒的积累量也显著降低。因此这些结果表明,提高本氏烟体内GSH的水平,可以减少TMV侵染造成的ROS积累,减轻细胞膜受到的氧化损伤,减少TMV病毒的积累量,增强了本氏烟对TMV的抗性,而抑制GSH的合成,将会削弱植物对TMV的抗性。为了进一步研究GSH与SA介导的防御途径的关系,我们检测了本氏烟中SA合成和信号途径的关键基因NbICS1(合成途径),NbNPR1(信号途径),以及SA介导的病程相关蛋白基因NbPR1,NbPR2,NbPR5的表达。结果表明外施GSH、OTC和瞬时过量表达NbECS都能增强NbICS1,NbNPR1,NbPR1,NbPR2和NbPR5的表达。而外施BSO和沉默NbECS、NbGS则会抑制NbICS1,NbNPR1,NbPR1,NbPR2和NbPR5的表达。因此,GSH可能是通过调控SA的合成,激活SA介导的信号途径,促进SA介导的防御基因表达,提高了本氏烟对TMV的抗性。综上所述,GSH通过激活SA介导的信号通路,诱导本氏烟抗性的产生,提高了本氏烟抗TMV侵染的能力。我们的研究为改善植物抗病性,培育抗性品种,提高农作物的产量和质量提供理论支持。