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背景帕金森病(Pa rkinson’s Di sea se,PD)是一种中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失的神经退行性疾病,最终导致纹状体内多巴胺水平降低。其临床主要表现为静息时颤抖、动作缓慢、僵直等运动障碍以及便秘、睡眠障碍、嗅觉损伤、抑郁、记忆损伤等一系列非运动障碍。目前尚无有效根治的方法,临床主要采用左旋多巴直接补充脑内多巴胺的缺乏,而长期使用左旋多巴会导致患者产生非正常性运动(异动症)和认知障碍。传统中医临床显示某些经典中药方剂对缓解帕金森病症状有良好效果,且可改善由长期服用左旋多巴引起的不良反应。造成PD的原因涉及环境、遗传以及二者的相互作用等诸多方面,近年来在PD的发病机制研究中,线粒体所扮演的角色越来越受到重视。已发现1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)、6-OHDA和杀虫剂百草枯等通过抑制脑内线粒体酶复合体I可在短期内导致PD样症状,这些药物目前已被广泛用于建立PD动物和细胞模型。除此以外,PD发病相关隐性基因PINK1和Parkin被证明与线粒体有直接的联系,其对线粒体形态、质量控制、膜电位等有很大影响。线粒体异常时,PINKl大量聚集于线粒体外膜,召集并磷酸化Parkin蛋白,而激活后的Parkin蛋白则行使其E3连接酶功能,使线粒体外膜相关蛋白泛素化标记,从而引起线粒体自噬等一系列变化。大补阴丸(DBYW)和牵正散(QZS)均是临床较常见的治疗PD的中药方剂,前期课题组的研究显示其在一定程度上可调控PD模型小鼠脑线粒体基因的表达、减轻线粒体DNA的损伤,对PD脑线粒体功能具有明确的保护作用,且两方合用(DBYW & QZS)效果更明显。目的运用分子生物学和生物化学方法从PINKl基因调控的角度观察DBYW & QZS对PD细胞线粒体的影响。从分子、细胞水平探索中药对PD细胞模型线粒体质量监控的作用环节,为临床应用DBYW & QZS治疗PD和中医合方理论提供科学及实验依据,也可为中药复方进一步开发利用奠定基础。方法1、利用人多巴胺能神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型、PINKl过表达模型以及PINKl-PD模型。2、实验分为10组：①空白对照组：正常培养细胞；②低、高浓度中药对照组：用含5μg/m1或25μg/ml DBYW & QZS的培养基处理细胞24h；③空白模型组：用含1mM MPP+的培养基处理细胞24h造模；④低、高浓度中药治疗组：造模后,换含5μg/ml或25μg/ml DBYW & QZS的培养基继续培养24h；⑤阴性对照组：转染阴性对照质粒,正常培养基；⑥阴性模型组：转染阴性质粒24h后,造模；⑦阴性治疗组：转染阴性质粒后,用MPP+造模,再换含5μg/ml DBYW & QZS的培养基处理24h；④PINKl过表达对照组：转染EGFP-PINK1过表达质粒,正常培养基；⑨PINKl过表达模型组：转染EGFP-PINK1过表达质粒后,造模；⑩PINK1过表达治疗组：转染EGFP-PINK1过表达质粒,造模,再换为含5μg/mlDBYW & QZS的培养基处理24h。3、采用CCK-8法对各组细胞进行细胞存活率检测。4、利用线粒体定向探针Mi toTracker(?) Red CMXRos和激光共聚焦显微镜观察各组线粒体的形态和分布,Image J软件进行图像处理和数据测量分析。5、对各组细胞线粒体功能的检测,包括：①利用线粒体探针TMRM对各组细胞线粒体膜电位(△平m)进行检测,②利用细胞ATP检测试剂盒荧光素酶法检测细胞ATP水平变化。6、选择线粒体外膜Tom20蛋白作为线粒体标记蛋白,使用免疫荧光双标技术检测各组细胞Parkin蛋白相对于线粒体的定位关系。结果1、大补阴丸合牵正散给药浓度筛选实验中的五个浓度梯度对SH-SY5Y细胞存活率均无抑制作用,最终选择5μg/ml作为后续实验给药浓度。2、细胞存活率影响1mM MPP+处理24h可造成细胞存活率下降50%左右(P<0.001),大补阴丸合牵正散以及PINK1过表达对细胞存活率无明显影响。3、线粒体形态影响中药单独处理正常细胞可使线粒体形态因子显著增加(P<0.01),MPP+处理则可降低线粒体长度(P<0.001),与模型组相比,治疗组的线粒体长宽比显著增加(P<0.0 5),线粒体长度更长；与阴性对照相比,PINK1过表达可造成线粒体形态因子和长宽比显著降低(P<0.001),但PINK1-PD模型线粒体相较于PINKl过表达组无明显变化；PINK1-PD模型治疗组相较于模型组在形态因子和长宽比上均显著增加(P<0.001)。4、线粒体膜电位(△ψm)影响MPP+处理可造成△Ψm显著下降(P<0.01),与阴性对照组相比,过表达PINK1并不影响△Ψm,治疗组△Ψm较模型组有一定增加趋势,但不明显。5、细胞ATP水平的影响MPP+处理可造成细胞ATP水平下降15%左右,而PINK1过表达可使细胞ATP水平显著增加(P<0.05),大补阴丸和牵正散对模型细胞ATP水平无明显提高作用。6、Parkin蛋白的线粒体定位过表达PINKl可显著增加Parkin蛋白的线粒体定位(P<0.05),MPP+处理也可增加Parkin的线粒体定位。大补阴丸合牵正散则有降低各模型组Parkin线粒体定位的趋势。结论1、大补阴丸合牵正散水煎剂对SH-SY5Y细胞无明显毒副作用。2、大补阴丸合牵正散水煎剂可促进正常细胞线粒体形成网络,增加PD模型细胞线粒体长度,对MPP+引起的线粒体形态损伤起到一定保护作用；此外,也表现出对维持细胞ATP水平和△Ψm有一定效果。3、PINK1过表达可使线粒体断裂增加,细胞ATP水平上升,Parkin线粒体定位明显,并表现出对MPP+损伤有一定抗性。4、大补阴丸合牵正散水煎剂可增加PINK1-PD细胞线粒体长度,对维持PINK1-PD细胞ATP水平及维持△ψm有一定效果。