ZNF259通过FAK-AKT信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭的研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fairylky
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目的:  肺癌现今是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,与细胞增殖、侵袭、转移有关的信号途径的异常启动是肿瘤进展的关键原因。因此,全面理解肺癌细胞增殖、侵袭和转移的分子机制,发现新的肺癌生物学行为的标记物,不仅为肺癌患者的临床治疗和预后评估带来益处,也可为开发新的靶向治疗药物提供依据,提高临床治疗手段,具有重要的理论和现实意义。  ZNF259,也被称为ZPR1,是一种锌指蛋白,Gangwani L等人已经证明在各种真核细胞中ZNF259为维持细胞存活所必需,其在早期胚胎发育中起着重要作用,其缺乏能够引起生长圆锥回缩、轴突缺陷以及细胞凋亡。Gangwani L同时证明了ZNF259在Hela细胞中分布在细胞质和细胞核,在增殖时主要表现为亚细胞分布的变化。ZNF259在S期定位于细胞核,能够加速细胞周期的进程,ZNF259缺乏能够引起转录和细胞周期进程的缺陷。  然而,迄今为止,ZNF259在人类肺癌中的表达模式和分子机制尚无报道。在本实验中,我们用免疫组织化学的方法检测了人类非小细胞肺癌标本中ZNF259的表达,发现ZNF259在癌旁组织细胞质中高表达,而在非小细胞肺癌标本中呈现微弱的细胞质表达,提示ZNF259在恶性肿瘤中可能发挥独特的生物学功能。  在本研究中,我们探索了ZNF259在肺癌组织和细胞系中的蛋白表达水平和亚细胞分布,以及它们的临床病理相关性。我们也研究了在非小细胞肺癌细胞系中过表达或者消耗ZNF259后对细胞增殖和侵袭的影响。我们发现ZNF259能够通过抑制FAK-AKT信号传导通路的激活来抑制非小细胞肺癌细胞系的增殖和侵袭。我们的研究为ZNF259作为肺癌治疗的潜在靶点提供了初步的理论和实验依据。  方法:  病人和标本:本研究是由中国医科大学的地方机构审查委员会批准开展的,组织标本来源于114例病人(男性86例、女性28例),均为2012-2014年间在中国医科大学附属盛京医院被诊断为非小细胞肺癌而在胸外科接受完整的手术切除的患者,114例中有35例有相对应的癌旁肺组织。患者在手术前均没有接受放疗或者化疗。按照世界卫生组织(WHO)2015年肺部肿瘤分类方法进行组织学诊断和分级。所有114例标本都进行了组织学亚型分类、分化程度分析和肿瘤分期。肿瘤分期是按照国际抗癌联盟(UICC)肺癌TNM分期系统第七版来进行的。114例病人的中位数年龄是57岁(从29岁到79岁),其中有68位病人大于或等于57岁,46位病人小于57岁。样本中分别包括42例肺鳞状细胞癌、54例肺腺癌和18例其他组织学类型的肺癌,16例高分化、44例中分化和34例低分化肺癌。114例患者中有52例出现淋巴结转移,Ⅰ-Ⅱ期患者61例,Ⅲ期患者53例。此外,其中20例有新鲜的包括肿瘤组织和配对癌旁组织的标本,切除后立即保存在-80℃冰箱内,用于提取蛋白和免疫印记检测ZNF259在肺癌组织的表达情况。  免疫组织化学:标本固定、包埋、切片,免疫染色采用链霉亲和素-过氧化物酶方法。染色强度评分分为0分(无着色)、1分(淡黄着色)、2分(黄色着色、细颗粒状)、3分(褐色着色)。染色细胞百分比评分分为0分(无着色)、1分(1-25%着色)、2分(26-50%着色)、3分(51-75%着色)、4分(76-100%着色)。两者乘积得分≥4定义为ZNF259阳性表达,得分0-3定义为阴性表达。  细胞系:HBE细胞系从美国模式菌种收集中心获得,A549、H460、SPC、H1299细胞系从上海细胞库获得,LK2细胞系由Hiroshi Kijima教授赠送,人肺ADC Anip973和AGZY83a细胞系从上海拜力生物科技有限公司购买。  蛋白免疫印迹:总蛋白使用裂解缓冲液提取,用Bradford法定量。取60微克的总蛋白通过10%浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳,然后转印到PVDF膜上。膜用一抗4℃过夜孵育,洗膜后用过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2小时。结合蛋白用电化学发光进行显像,用生物成像系统进行检测。实验重复3次。  质粒转染和小干扰RNA处理:质粒pCMV6-ddk-myc和pCMV6-ddk-myc-ZNF259购于Origene,ZNF259-siRNA和NC-siRNA购于Santa Cruz Biotechnology。使用试剂Lipofectamine3000按照说明书进行转染。  基质胶侵袭:使用含有8μm孔滤膜的transwell小室,底部用基质胶包被。细胞转染48小时后消化,将含有3×105个细胞的100μl无血清培养基转移到基底膜的上室,下室放含有10%小牛血清的培养基,18小时后,通过滤膜的细胞固定、染色。用显微镜随机取10个高倍视野计数,实验重复三次,取平均值。  划痕实验:转染48小时后当培养细胞至密度小于90%时进行划痕,在不同时间点观察、拍照划痕愈合情况。每个实验一式两份孔,实验重复3次。划痕的光学距离使用Image J软件测定。  MTT实验:细胞转染24小时后按照每孔约3000个细胞量将细胞铺到96孔板中,用含10%小牛血清的培养基培养。用MTT法对细胞活性进行定量,用分光光度计检测570nm波长的吸收峰值进行定量。  克隆形成实验:转染或干扰ZNF259后48h的细胞,接种到培养皿中(每皿为1000个细胞)孵育12天。染色后用显微镜计数超过50个细胞的集落数,实验重复三次,取平均值。  结果:  1、我们采用免疫组化的方法检测ZNF259在114例非小细胞肺癌标本中的表达和亚细胞定位。结果显示ZNF259在癌旁组织细胞浆中高表达,在肺癌组织中呈细胞浆低表达,ZNF259在癌旁组织中的阳性率明显高于在癌组织中的阳性率(71.4%,25/35Vs53.5%,61/114,P<0.05)。随后的统计分析结果显示ZNF259的表达与肿瘤大小(P=0.001)、TNM分期(P=0.002)、淋巴结转移(P=0.02)负相关,而与年龄(P=0.251)、性别(P=0.188)、分化(P=0.858)和组织学类型(P=0.161)无关。我们也检测了ZNF259在非小细胞肺癌新鲜标本中的蛋白表达水平,蛋白免疫印迹结果提示ZNF259在正常肺组织中的蛋白水平(Mean±SD:1.0221±0.01024)明显高于非小细胞肺癌标本中的蛋白水平(Mean±SD:0.7574±0.07265,P=0.016)。我们也检测了ZNF259在非小细胞肺癌细胞系中的表达情况,结果显示ZNF259在正常支气管上皮永生化的细胞系HBE中高表达,在7种非小细胞肺癌细胞系的6种中表达降低(除了H460细胞)。  2、我们在A549细胞中过表达ZNF259或者用siRNA抑制ZNF259的表达。MTT和克隆形成实验结果显示过表达ZNF259后A549细胞的增殖能力降低。相反,我们在A549细胞中用siRNA干扰ZNF259的表达,细胞的增殖能力增加。我们接着用免疫印迹的方法检测细胞周期蛋白的表达,结果显示在A549细胞中过表达或者抑制ZNF259时CyclinD1蛋白表达下调或者上调,然而,其他的蛋白例如CyclinE1、CDK4和CDK6没有明显的变化。  3、我们研究在A549细胞中过表达或者抑制ZNF259的表达后对非小细胞肺癌侵袭和转移的影响。划痕实验和transwell实验结果显示在过表达ZNF259后A549细胞的迁移和侵袭能力受抑制,而用siRNA抑制ZNF259的表达后细胞的迁移和侵袭能力增强,免疫印迹结果提示过表达或者抑制ZNF259时MMP2表达下调或者上调,其他的蛋白例如MMP9、Snail和E-cadherin没有改变。  4、最后,我们筛选参与调控减少MMP2和CyclinD1蛋白表达的主要细胞信号传导通路因子。在A549细胞中过表达ZNF259后,我们发现酪氨酸397位点磷酸化的FAK和苏氨酸308位点磷酸化的AKT表达减少,而在干扰ZNF259后两者的磷酸化蛋白表达增加,而其他的信号通路蛋白没有明显的改变。下一步我们就要检测MMP2和CyclinD1蛋白的增加是不是由FAK和AKT信号通路激活引起的。在A549细胞中干扰ZNF259后,分别使用FAK特异性抑制剂(PF-562271)和AKT特异性抑制剂(LY294002),此时,MMP2和CyclinD1的表达不再上调,苏氨酸308位点磷酸化的AKT表达也被抑制不再上调。然而当抑制FAK信号通路时,酪氨酸397位点磷酸化的FAK表达水平没有变化不再上调,当抑制AKT信号通路时,酪氨酸397位点磷酸化的FAK表达水平没有变化仍然上调。上述结果显示在ZNF259引起的变化中FAK是AKT的上游影响因素。  结论:  1、ZNF259在正常肺组织和细胞系中表达于细胞浆,在肺癌中表达下调;ZNF259的表达与肿瘤大小、高TNM分期、阳性淋巴结转移等恶性表型明显负相关。  2、ZNF259能够抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭。  3、ZNF259抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭是通过抑制FAK-AKT信号通路实现的。
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