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【目的】以烟曲霉内转录间隔区(ITSD)为靶序列,筛选烟曲霉菌特异性的引物对,应用重组酶介导的等温核酸扩增(RPA)技术建立快速检测烟曲霉的新方法并对该检测方法进行方法学优化。【方法】(1)以烟曲霉菌的易变区内转录间隔区为靶序列,先用Primer-5软件在不同区间设计三条上游引物和三条下游引物,交叉配对组成不同引物对,然后将引物逐一进行Primer-blast,筛选烟曲霉的特异性引物。(2)应用机械性玻璃珠打击裂解法抽提获得烟曲霉标准菌株的DNA。(3)通过优化RPA检测烟曲霉的引物长度、产物长度、扩增时间及扩增温度等检测条件,建立检测烟曲霉的新方法。(4)通过交叉扩增实验及检测不同浓度烟曲霉DNA样品来评估RPA检测烟曲霉菌的敏感性和特异性。(5)通过对21株临床分离的人致病性曲霉菌菌株的检测来评估RPA技术的临床检测性能。(6)通过RPA与PCR同时进行敏感性、特异性、临床分离曲霉菌检测试验,对RPA与PCR技术进行方法学比较。【结果】(1)筛选得到烟曲霉特异性的引物为上游位于ITSD1、下游位于ITSD2、扩增产物为489bp的引物。引物序列为:上游引物:5’-GGTCCAACCTCCCACCCGTGTCTATC-3’,下游引物:5’-TTAGAAAAATAAAGTTGGGTGTCGGC-3’(2)通过机械性玻璃珠打击裂解法抽提获得的烟曲霉基因组DNA在纯度和的量上能够满足核酸扩增需要,且简便、快速。(3)RPA技术检测烟曲霉菌的优化反应条件为:引物长度范围为18-32bp;扩增产物长度范围为200-700bp;扩增温度为37-42℃;扩增时间为15-40min。(4)RPA特异性和敏感性:不同曲霉菌种交叉扩增实验显示,RPA只在烟曲霉菌扩增中有明显的特异性条带,而对黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、中国红酵母均无扩增。在以琼脂糖凝胶电泳为检测平台时,RPA可以检测到最低浓度为100pg/μl的烟曲霉DNA样品。(5)21株临床分离的人致病性曲霉菌检测实验中,RPA对18株烟曲霉分离菌株的扩增均为阳性,而3株黄曲霉扩增均为阴性。(6)通过对RPA和PCR检测烟曲霉方法学的比较,RPA和PCR一样具有很高的敏感性和很强的特异性。【结论】本研究通过Primer-Blast筛选针对烟曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的特异性引物。在优化反应条件下,应用此特异性引物建立的RPA检测烟曲霉方法可以在较低的恒温条件下对烟曲霉菌DNA进行有效扩增,具有简便、快速、成本低的特点,而且与PCR技术具有相同的敏感性和和特异性,适合用于烟曲霉菌的快速检测和鉴定。