摘要甘薯(Ipomoea batatas (L) Lam.)在分类学上属于旋花科甘薯属甘薯种,为一年生或多年生蔓生草本,在热带、亚热带和温带广泛种植,是重要的粮食、饲料和工业原料作物。花色素苷(anthocyanin)广泛存在于开花植物中,是一类重要的水溶性的类黄酮化合物,是花色素(anthocyanidin)与各种单糖通过糖苷键结合形成的糖基化衍生物的总称。紫肉甘薯是指薯肉颜色为紫色的甘薯,由于富含花色素苷而在近年被认定为特用品种,有较高的食用和药用价值,紫肉甘薯含有的天然花色素苷具有广泛的生理活性,如抗氧化、降血糖、抑制遗传因子突变等作用。虽然紫肉甘薯保健功能已经开始为大众知晓,但对紫肉甘薯花色素苷生物合成的分子调控机理却研究甚少,培育高花色素苷含量的紫肉甘薯品种难以实现。本论文旨在通过对紫肉甘薯花色素苷生物合成途径中重要基因的克隆和功能研究阐明紫肉甘薯花色素苷生物合成的分子调控机理,为培育高花色素苷含量紫肉甘薯打下理论基础,也为以紫肉甘薯为植物代谢生物反应器生产花色素苷提供理论依据。主要结果如下：1.紫肉甘薯二氢黄酮醇-4-还原酶基因(IbDFR)的克隆及其功能研究采用同源克隆的策略和RACE方法,从紫肉甘薯渝紫263中克隆了二氢黄酮醇-4-还原酶基因IbDFR的全长cDNA序列(Genbank登录号为HQ441167)。序列分析表明,IbDFR基因cDNA全长为1392 bp,含有一个1182 bp的ORF,编码一个394个aa的蛋白。NCBI的blastn和blastp表明,IbDFR基因的核酸与已知的DFR基因核酸序列有高度的同源性,尤其与牵牛花DFR基因最相似,达96%；IbDFR蛋白氨基酸序列与许多已知的植物DFR蛋白具有很高的相似性,其中与同为旋花科的牵牛花InDFR同源性最高,相似性达94%。聚类分析表明,甘薯IbDFR与同属旋花科的牵牛花InDFR同聚为一小枝。对IbDFR保守结构域搜索表明,IbDFR基因编码蛋白含有高度保守的与NADPH结合和底物特异结合的保守基序,与已知结构和功能的DFR蛋白的活性位点和高级结构基本相同,因而推断IbDFR蛋白具有生物学功能。构建了IbDFR基因的植物表达载体,并对烟草W38进行了转化,获得了转基因烟草植株,对转基因烟草花期IbDFR基因的表达情况进行了分析。将所获得的再生植株炼苗后移栽到试验地种植,都能正常生长发育,在生长期观察,与野生型烟草比较,转基因烟草植株在生长势、株型等性状没有明显区别。在开花期明显地观察到,转基因植株中有花色明显加深的单株(9号)出现,花器官中花色素苷含量显著提高,与野生型比较增量为50%左右,证实IbDFR基因在强启动子作用下能够对烟草的花色素苷含量起到上调作用。在随后的荧光定量PCR检测中,9号单株IbDFR基因的高表达进一步证实转基因烟草中花色素苷含量的提高与转入的IbDFR在对花色素苷合成途径起上调作用的一致性。在所获得的转基因烟草1号和7号植株,虽经PCR检测为阳性,但却未能表现IbDFR基因的功能,这很可能是由于转入的IbDFR基因沉默所致,从荧光定量PCR检测结果也可以看出1号相对表达量很微弱,7号相对表达量也很低。构建了IbDFR基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了IbDFR蛋白,通过Ni柱离子交换层析的方法纯化了目标蛋白。用圆二色谱对重组蛋白分析二级结构的组成分别为：α螺旋13.9%,p折叠41.2%,转角10.1%,无规卷曲34.7%,即重组蛋白中主要以β折叠和无规卷曲为主。但是通过氨基酸序列在Expasy网站利用SOPMA预测[bDFR蛋白的二级结构发现其包含153α螺旋,49β折叠,25转角和167无规卷曲,即分别占38.83%、12.44%、6.35%和42.39%,即以α螺旋和无规卷曲为主。以(±)taxifolin为底物进行了酶活实验,重组蛋白酶活测定结果表明,原核表达的IbDFR重组蛋白在辅因子NADPH的作用下能够催化底物(±)taxifolin转变为下游物质,说明重组蛋白具有酶的活性。圆二色谱测定结果和预测结果的不一致,说明原核表达的重组蛋白和植物体内的蛋白在折叠上可能存在不一致,同时也说明原核表达的蛋白在折叠时能形成与NADPH以及底物结合的保守结构域。酶活测定结果也充分说明该酶在花色素苷生物合成途径中的关键作用。2.紫肉甘薯黄烷酮-3-羟化酶(IbF3H)和花色素合成酶(IbANS)基因克隆与特征分析采用同源克隆的策略和RACE方法,从紫肉甘薯渝紫263中克隆了紫肉甘薯黄烷酮-3-羟化酶(IbF3H)和花色素合成酶(IbANS)基因的全长cDNA序列(Genbank登录号分别为HQ441168和GU598212)。紫肉甘薯IbF3H基因cDNA物理全长为1280 bp,包括5’端UTR、3’端UTR和polyA尾巴以及包括一个编码368个氨基酸残基的编码区,IbF3H蛋白具有结合亚铁离子的保守氨基酸H219、D221和H277,结合酮戊二酸的RXS基序R287-S289,结构域位于蛋白的核心,即Fe2+被包埋在酶的中心。紫肉甘薯IbANS基因cDNA物理全长为1375 bp,包括5’端UTR、3’端UTR和polyA尾巴以及包括一个编码362个氨基酸残基的编码区,NCBI保守域搜索结果表明,IbANS蛋白也具有结合亚铁离子的保守氨基酸H242、D244、H298和结合酮戊二酸的RXS基序R308-S310,和IbF3H一样同属于类黄酮合成途径的2-ODD酶家族。将IbF3H禾口IbANS的序列与cDNA中其他F3H和ANS分别比对发现,这两个基因与其他物种中该基因有很高的序GenBank列相似性,蛋白的同源比对与系统进化分析结果表明,与近缘物种氨基酸相似性较高,并能与同属旋花科的植物F3H或ANS聚为一小枝。生物信息学分析结果说明,从紫肉甘薯所克隆得到的IbF3H和bANS cDNA为植物普遍存在的F3H和ANS基因,并具有生物学活性。3.紫肉甘薯花色素苷的生物合成与黄烷酮-3-羟化酶(IbF3H)、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(IbDFR)和花色素合成酶(IbANS)基因的组织表达特征分析采用嫁接的方法分析了甘薯花色素合成的特点,并通过已克隆到的紫肉甘薯花色素苷合成途径中的三个关键基因IbF3H、IbDFR、IbANS,利用荧光定量分析方法对渝紫263各部位组织(须根、0.5 cm块根、3.0 cm块根、外周皮、茎节、茎中部、叶柄、叶片、幼茎尖)结构基因的表达状况进行了分析：(1)ps53和ps53+263包括块根(TR)和须根(FR)在内的各个组织花色素苷相对含量都很低；渝紫263和263+ps53的块根(TR)及须根(FR)的花色素苷相对含量明显高于其他类型组织；263+ps53嫁接苗的块根(TR)及须根(FR)中花色素苷相对含量高于渝紫263相应组织,嫁接后花色素苷得到累积。可以推测：紫肉甘薯渝紫263花色素苷的生物合成主要在块根中完成,之后再运输到须根及茎、叶等其他组织器官。(2)对渝紫263各部位组织中IbF3H、IbDFR、IbANS基因的荧光定量分析和这些组织中花色素苷的相对含量测定结果说明,IbF3H、IbDFR、IbANS在0.5 cm块根、3.0 cm块根、外周皮中表达量明显高于在茎节、茎中部、叶柄、叶片、幼茎尖等组织中的表达量；在0.5 cm块根、3.0 cm块根、外周皮中花色素苷含量较高是由于结构基因高效表达的结果。紫肉甘薯花色素苷含量与花色素苷合成途径中结构基因的表达密切相关。基因在甘薯块根的组织特异表达,是紫肉甘薯块根花色素苷含量高的主要原因,这也解释了嫁接实验中紫肉甘薯的形成只和地下部分品种有关而和地上部分薯苗品种无关。