松树作为耐干旱适应性强的一种长寿植物,它的常青秘密就在于它的雄性生殖细胞——松花粉。松花粉药食兼用的历史已逾数千年,历代药典中松花粉的药用价值也被广泛记载。利用松花粉的历史可追溯到2400年前,东汉的《神农本草经》中就有记载,现代《中国药典》也将松花粉收录其中。在民间松花粉更是以其神奇的功效被奉为“仙药”。古医籍称松花粉“甘、温、无毒”,有“润心肺、益气、祛风止血、壮颜益志”等功能。　　 松花粉是天然的微型营养库。作为优良的保健食品,松花粉的营养成分可以分为糖、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素和生物活性物质六大类。其所含的多种酶、激素、黄酮等生物活性物质对人体的生命活动有重要的调节作用。花粉的结构可分为花粉壁和内含物,花粉壁含有复杂的有机化合物,能抗高温,耐强酸强碱、耐反射性。因此,花粉中营养成分、生命活性物质的提取、精制技术是松花粉能否有效利用的关键。超临界CO2萃取(SFE-CO2)是一种全新的提取分离技术,具有无易燃性、无化学反应、无毒、无污染、安全性高、操作简单等优点,在天然产物提取中越来越受到重视。传统中药达到符合国际标准的现代化可以通过SFE-CO2技术来实现。因此,本实验利用经超临界萃取技术提取后的松花粉,运用紫外可见分光光度法和HPLC法对其中的活性成分进行分析研究。　　 本文以超临界流体萃取松花粉(supercritical fluid extract of pine pollen,SFE-PP)为研究对象,对松花粉提取物的总黄酮,总磷脂以及甾醇类活性成分进行了分析和含量测定,同时通过建立小鼠力竭游泳运动模型和大鼠高脂血症模型,研究超临界萃取后的松花粉的抗疲劳和降血脂作用,以期对松花粉的进一步开发提供研究基础。　　 第一部分综述　　 主要对松花粉的药用活性成分及疲劳和高脂血症进行综述。主要包括:松花粉的历史及研究现状,松花粉的活性成分分析及药理作用,疲劳的中西医认识、产生机理及抗疲劳的检测指标,高血脂症的中西医治疗及其检测指标等,为论文后续实验工作的开展奠定理论基础。　　 第二部分超临界萃取松花粉的活性成分的含量测定　　 SFE-PP中总黄酮含量测定:建立紫外可见分光光度法测定松花粉提取物中总黄酮含量的方法,利用黄酮类化合物可与铝盐反应生成有色络合物的性质进行测定。实验结果表明在7.5～60μg·mL·-1的浓度范围内,芦丁的吸光度与浓度呈良好的线性关系,y=0.0099x+0.0289(r=0.9990,n=5)；总平均回收率98.71％。根据本方法进行测定,松花粉提取物中总黄酮的含量为1.42±0.02 mg·g-1(n=3),RSD为1.07％。　　 SFE-PP中总磷脂含量测定:建立紫外分光光度法测定松花粉提取物中总磷脂含量的方法,将试样中的有机磷转变成无机磷,利用磷酸根离子与钼酸铵作用的产物——磷钼酸铵,遇抗坏血酸被还原成蓝色络合物钼蓝的性质进行测定。实验结果表明在0.342～1.710μg·mL-1的浓度范围内,磷标准液的吸光度与浓度呈良好的线性关系,y=0.3939x+0.0041(r=0.9997,n=5)；总平均回收率99.03％。根据本方法进行测定,松花粉提取物中总磷脂的含量为30.04±0.34 mg·g-1(n=4),RSD为1.14％。方法建立后分别对显色条件(料液比、消化时间)进行单因素考察,确定料液比为4:10,反应3 h为最优。　　 SFE-PP中β-谷甾醇含量测定:通过GC-MS分析,确定试样中甾醇类主要成分是β-谷甾醇。建立高效液相色谱法测定松花粉提取物中β-谷甾醇含量的方法。实验结果表明在10～100μg·mL-1的浓度范围内,β-谷甾醇标准品的峰面积与浓度呈良好的线性关系,y=2141.1x+1146.3(r=0.9999,n=5)；总平均回收率97.94％。根据本方法测定得松花粉提取物中β-谷甾醇的含量为31.95±0.25 mg·g-1(n=3),RSD为0.79％。方法建立后,以正交实验对料液比、KOH醇溶液浓度及皂化反应温度这三个条件进行优化,确定最优提取条件为:料液比1:20,KOH醇溶液浓度1 mol·L-1,皂化反应温度95℃。以上述最优条件对皂化反应提取时间进行单因素考察,得出3 h为最佳提取时间。　　 第三部分超临界萃取松花粉提取物的抗疲劳研究　　 在SFE—PP抗疲劳作用研究中,采用小鼠力竭游泳运动模型,240只小鼠随机均分为5组:空白对照组,阳性对照组,SFE-PP低中高三个剂量组。阳性对照组和SFE-PP低中高三个剂量组分别给以411 mg·kg-1人参0.5％CMC-Na混悬液和不同浓度的SFE-PP0.5％CMC-Na混悬液灌胃,空白对照组以0.5％CMC-Na灌胃,连续33 d。通过小鼠负重游泳实验测定小鼠游泳时间；测定小鼠本身肝糖原含量及不负重游泳后测定小鼠血清尿素氮(BUN)含量、血乳酸(LA)含量及观察了SFE-PP的抗疲劳作用。　　 结果表明,SFE-PP低、中、高剂量组和阳性对照组均可延长小鼠负重游泳时间,提高小鼠的肝糖元含量,降低疲劳小鼠BUN含量,降低小鼠游泳10 min后LA含量,证明SFE—PP有一定的抗疲劳作用。　　 第四部分超临界萃取松花粉提取物的调节血脂研究　　 利用高脂饲料饲喂SD大鼠,成功建立了高脂血大鼠模型。48只大鼠随机分为6组:空白对照组,高脂模型组,阳性对照组,SFE-PP低中高三个剂量组。阳性对照组和SFE-PP低中高三个剂量组分别以220.6 mg·kg-1大豆卵磷脂0.5％CMC-Na混悬液和不同浓度的SFE-PP0.5％CMC-Na混悬液灌胃,空白对照组和高脂模型组以0.5％CMC-Na灌胃,连续45 d。通过测定血清TG、TC、LDL-C、HDL-C指标评价SFE-PP的降血脂作用。　　 结果表明,SFE—PP低、中、高剂量组和阳性对照组相比高脂模型组对高血脂有显著降低TG、TC、LDL-C水平和升高HDL-C水平的作用。