胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是胃液和(或)十二指肠液反流入食管而引起烧心反流等症状,可引起反流性食管炎,以及咽喉、气管等食管以外的组织损害。我国的GERD患病率呈逐年增长趋势,已成为消化系统最为常见的慢性疾病。GERD发病机制迄今尚未完全阐明。随着高分辨食管测压的推广应用,从食管动力学角度探讨GERD的研究深入,胃食管连接处收缩积分降低、一过性食管下括约肌松弛、低食管下括约肌压力、无效食管运动被认为是GERD发生的主要食管动力障碍。GERD可归属于中医“噎膈”、“胸痛”、“吐酸”、“嘈杂”、“胃脘痛”等范畴。1997年3月4日国家技术监督局颁布的国家标准《中医临床诊疗术语·疾病病部》将本病命名为“食管瘅”。中医认为,本病多因脾胃素虚,内外之邪乘虚袭入,使“清气”不升,“浊气”不降所致。在胃食管反流病中医诊疗共识意见(2017年)中六君子合旋覆代赭汤主治中虚气逆之证,可以改善中虚气逆引起的反酸、泛吐清涎、嗳气、胃脘隐痛等症状。Cajal间质细胞(interestitial cells of Cajal,ICC)是胃肠神经与平滑肌的中间媒介,对从神经到平滑肌的信号传递起重要作用,胃肠神经、ICC、平滑肌细胞共同形成复杂的控制系统。ICC以网络形式广泛分布于胃肠道,ICC数目的减少、结构的异常与GERD等众多的胃肠动力障碍疾病相关。Groneber等研究证明了 ICC分化异常是导致GERD形成的重要原因。ICC内Ca2+水平及钙振荡是ICC产生和传导慢波的前提。有学者证明三磷酸肌醇受体(IP3Rs)引起内质网钙库释放Ca2+及线粒体Ca2+再摄取导致的钙振荡(细胞内规律性Ca2+浓度变化)是引起ICC起搏功能的基础。所以,ICC内Ca2+浓度在维持ICC起搏功能及胃肠动力功能方面起着不可代替的作用。Cajal间质细胞是胃肠道的起搏细胞,与GERD的食管动力障碍发生密切相关。健脾理气中药对ICC的活性及其与Ca2+浓度的影响国内外未见报道。中医中药干预GERD的优势在于疗效好,副作用少,能够很大程度上降低GERD的复发风险,但GERD中药干预的疗效与食管动力的相关性及具体细胞机制未见报道。通过此次研究,初步揭示GERD相关客观指标的变化及中医中药干预后疗效的变化之间的相关性,从而为GERD的中医药防治作用及机制研究奠定基础。第一部分大鼠胃Cajal间质细胞的分离、培养和鉴定目的:分离、培养和鉴定大鼠胃Cajal间质细胞。方法:选取出生10～15d的Wistar大鼠3只,禁食18h后无菌下取1cm左右胃窦组织,分离出平滑肌肌条,剪碎后通过Ⅱ型胶原酶酶解法提取ICC,接种于含有M199培养基营养液的六孔板上,稳定培养7～8d后采用c-kit免疫荧光法鉴定。结果:倒置显微镜下可见ICC呈三角形、梭形或多边形,核大,胞体突起与周围细胞的胞体和突起相互连接。免疫荧光染色ICC表面c-kit呈阳性。结论:成功进行了 ICC的培养与鉴定,为后续探讨ICC与胃食管动力障碍疾病关系的研究奠定了基础。第二部分六君子汤合旋覆代赭含药血清的制备及有效成分研究目的:制备六君子汤合旋覆代赭汤含药血清,并探究复方制剂及大鼠含药血清中白术内酯Ⅲ、槲皮素、茯苓酸三种活性成分的含量。方法:Wistar大鼠分为中药低、中、高剂量组和空白组,分别予以浓度为0.846、1.728、3.456 g/ml六君子汤合旋覆代赭汤溶液和生理盐水灌胃5天后腹主动脉取血制备含药血清。基于液质联用技术,测定复方制剂及含药血清有效成分。结果:制备了该复方的大鼠含药血清,并测得复方试剂供试液中各有效成分的平均浓度:白术内酯Ⅲ4109.12mg·-1;槲皮素50.70mg·L-1;茯苓酸0.666mg·L-1;含药血清中白术内酯Ⅲ的平均浓度为55.75mg·L-1。结论:白术内酯Ⅲ可能是六君子汤合旋覆代赭汤的药效物质基础之一。第三部分六君子汤合旋覆代赭汤含药血清对大鼠胃Cajal间质细胞活性及钙离子浓度的影响目的:探讨六君子汤合旋覆代赭汤治疗胃食管反流病的可能作用机制。方法:ICC稳定培养7～8d后,调整浓度为5×104/ml接种于96孔板,分为中药低、中、高剂量组和莫沙必利组、空白组,12h后加入相应含药血清,200ul/孔,分别培养24、48、72h采用MTT法检测ICC活性;激光共聚焦显微镜下进行Fluo-3-AM荧光检测细胞内Ca2+浓度变化。结果:与空白组和中药低剂量组同期相比,中药中、高剂量组和莫沙必利组ICC活性均显著增强,Ca2+荧光强度升高(P<0.05);在48h、72h时莫沙必利组ICC活性显著高于中药中、高剂量组,Ca2+荧光强度亦高于中药中、高剂量组(P<0.05)。结论六君子汤合旋覆代赭汤可增强ICC内Ca2+浓度,从而提高ICC活性,这可能是其治疗胃食管反流病可能机制之一。第四部分六君子汤合旋覆代赭汤对GERD中虚气逆证患者食管动力影响目的:观察六君子汤合旋覆代赭汤对胃食管反流病中虚气逆证患者食管动力影响。方法:选择2017年3月至2019年3月在江苏省苏北人民医院就诊的33例GERD中虚气逆证患者,随机分为中药组和对照组,中药组17例,对照组16例,中药组予六君子汤合旋覆代赭汤治疗,对照组予莫沙必利片治疗。于服药前及服药后14d进行食管测压。结果:两组治疗后食管下括约肌静息压和食管下括约肌残余压均显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,中药组食管下括约肌残余压低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组治疗后食管远端收缩积分和远端收缩延迟时间均显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);两组治疗后收缩前沿速度降低,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后中药组食管远端收缩积分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:六君子汤合旋覆代赭汤可以明显改善GERD中虚气逆证患者的食管下括约肌静息压和残余压,增强食管体部蠕动功能。