【摘 要】
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导向农药是将农药有效成分与导向基团偶联后使其在植物体内具有良好的输导性,且可以在特定部位累积的新型农药。本实验室前期做了大量工作,包括系列糖基、氨基酸为载体的导向
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导向农药是将农药有效成分与导向基团偶联后使其在植物体内具有良好的输导性,且可以在特定部位累积的新型农药。本实验室前期做了大量工作,包括系列糖基、氨基酸为载体的导向农药的合成,杀虫活性评价,输导内吸性评价以及相关转运机理研究。草甘膦(Glyphosate)是一种使用较早的内吸灭生型除草剂,其在植株体内有良好的输导性。草甘膦分子结构中含有一个磷酸基团且已经证明磷酸盐转运蛋白参与了草甘膦的转运;草甘膦分子结构与甘氨酸高度相似,在抗草甘膦杂草中,草甘膦被ABC家族的氨基酸转运蛋白转运至液泡中;草甘膦还可以被哺乳动物上皮组织细胞中氨基酸转运蛋白LAT1转运至动物体内。现已证明拟南芥氨基酸转运蛋白LHT1是根部吸收中性氨基酸和酸性氨基酸的关键转运蛋白,其缺失影响植物对氨基酸的吸收和分布。LHT1还可以转运带有氨基酸结构的甘氨酸甲酯-氯虫苯甲酰胺(CAP-Gly-2)。本论文以拟南芥氨基酸转运蛋白LHT1为主要研究对象,结合荧光共振能量转移(FRET)技术,进一步研究LHT1是否参与草甘膦的转运。首先构建CFP-LHT1-YFP的“三明治”探针,将该探针分别连接到pRSET-A和pDR196载体上,分别在BL21原核细胞和BY4741酵母细胞中表达该探针。将纯化后的原核表达探针蛋白分别与供试氨基酸和草甘膦混合后,经荧光酶标仪检测,其结果表明:用甘氨酸和谷氨酸处理的阳性对照组,有明显的FRET变化;草甘膦处理后的变化趋势与甘氨酸、谷氨酸类似;精氨酸和PBS处理的阴性对照组无明显FRET变化。并且FRET变化受底物浓度和pH的影响。正确表达FRET探针的酵母细胞被用于光漂白试验,检测单个细胞的FRET变化情况。利用光漂白法研究氨基酸或草甘膦处理后,单个酵母细胞的FRET变化,结果与荧光酶标仪检测的结果一致。本论文成功构建基于拟南芥氨基酸转运蛋白LHT1的FRET探针,通过原核表达系统和酵母真核表达系统分别证明LHT1具有结合草甘膦的能力,推测其在植株水平可以转运草甘膦,同时该探针还可以进一步用于其他导向农药的筛选。
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