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目的1明确ERK信号通路和蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)大鼠海马区神经细胞自噬的关系及后者在早期脑损伤(early brain Injury,EBI)中的作用。2探讨亚低温(Mild hypothermia,MH)治疗对SAH后神经细胞的保护作用及可能机制。方法将120只雄性SD大鼠随机数字表法依次分为假手术组(Sham组)、蛛网膜下腔出血模型组(SAH组)、ERK信号通路抑制剂组(SAH+U0126组)、亚低温治疗组(SAH+MH组)、亚低温治疗联合U0126干预组(SAH+U0126+MH组),共5组,每组24只大鼠,每组再次重新编号,采用随机数字表法按术后取材时间点(24h、72h)再次分为两个亚组,每个亚组各12只。利用血管内穿刺法制成大鼠SAH模型,Sham组只进行血管内穿刺但不穿破血管。SAH+U0126组于造模前0.5h通过尾静脉注射U0126溶液,给药剂量为0.05mg/kg。SAH+MH组造模后后使用小动物用电热毯,配合冰袋,酒精擦浴,进行6h的全身亚低温治疗,维持肛温在30±0.5℃;SAH+U0126+MH组于造模前0.5h按照给药要求通过尾静脉提前配置好的U0126溶液,0.05mg/kg,造模成功后立即给与上述亚低温干预。分别于造模成功后24h、72h处死大鼠,取脑。干湿重法检测脑水肿指数,HE染色观察海马CA1区神经细胞形态及对其死亡神经元进行定量分析;应用免疫组织化学染色及Western-Blot法检测pERK1/2蛋白以及自噬标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ在大鼠海马区的表达情况。结果1脑组织含水量检测发现:与Sham组比较,SAH组在24h、72h脑水肿指数均显著升高(P<0.05),与SAH组比较,U0126+SAH组脑水肿指数明显升高(P<0.05),SAH+MH组脑水肿指数显著下降(P<0.05),与SAH+MH组比较,SAH+MH+U0126组脑水肿指数显著升高(P<0.05);而与SAH组比较,SAH+MH+U0126组脑水肿指数无明显差异(P>0.05)。2细胞形态学结果(HE染色):Sham组大鼠海马CA1区可见神经元排列整齐、细胞核呈正圆形、核仁清晰可见,包浆淡然,偶可见轴突;SAH组可见神经元排列相对松散、层次结构紊乱,受到严重破坏,较多细胞核固缩深染,核仁消失,而周边组织溶解,呈现空泡状;与假手术组比较,SAH组在24h、72h海马区存活细胞率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与SAH组比较,SAH+U0126组在各时间点海马区细胞死亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与SAH组比较,SAH+MH组相应时间点海马区存活细胞率显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。3 Beclin-1、LC3免疫组化与Western blotting分析结果:免疫组化结果: Beclin-1、LC3免疫组化染色呈棕黄色,主要表达在神经元细胞包浆中;与S ha m组比较,SAH组在24h、72h细胞出现明显损害,可见大量坏死神经元,染色均增强,免疫阳性细胞数均增加,(P<0.05);与SAH组比较,SAH+U0126组神经细胞损害程度进一步加重,但其染色减弱,免疫阳性细胞数减少(P<0.05);与SAH组比较,SAH+MH组染色更深,免疫阳性细胞数量更多(P<0.05);SAH+U0126+MH组与SAH组比较,其神经细胞损伤及免疫阳性细胞数量并无明显差异(P>0.05),与SAH+MH组比较,其神经细胞损伤明显加重,免疫阳性细胞数量明显减少(P<0.05)。Western blotting结果:在Sham组中表达量非常少;与Sham组比较,SAH组在24h、72 h表达量显著增加(P<0.05);与SAH组比较,在SAH+U0126组其表达明显下降(P<0.05);与SAH组比较,SAH+MH组表达量明显上调(P<0.05);而SAH+MH+U0126组,与SAH组比较,其蛋白表达量无明显差异(P>0.05),与SAH+MH组比较,其蛋白含量显著下降(P<0.05)。4 p-ERK1/2免疫组化与Western blotting分析结果:免疫组化:p-ERK1/2在Sham组中有胞浆胞核弱表达,淡染;与Sham组比较,SAH组在24h、72h细胞染色均增强,免疫阳性细胞数均增加,(P<0.05);与SAH组比较,SAH+U0126组其染色减弱,免疫阳性细胞数减少(P<0.05);与SAH组比较,SAH+MH组染色更深,免疫阳性细胞数量更多(P<0.05);SAH+U0126+MH组与SAH组比较,其免疫阳性细胞数量并无明显差异(P>0.05),与SAH+MH组比较,其免疫阳性细胞数量明显减少(P<0.05)。Western blot结果:p-ERK1/2在Sham组中表达量非常少;与Sham组比较,SAH组表达量显著增加(P<0.05);与SAH组比较,在SAH+U0126组其表达明显下降(P<0.05);与SAH组比较,SAH+MH组表达量明显上调(P<0.05);而SAH+MH+U0126组,与SAH组比较,其蛋白表达量无明显差异(P>0.05),与SAH+MH组比较,其蛋白含量显著下降(P<0.05)。结论1 SAH后EBI阶段自噬水平上调,其具有神经保护作用;ERK信号通路可能参与自噬的激活,抑制ERK信号通路后自噬水平下调,神经损伤加重。2亚低温治疗具有神经保护作用,其机制可能是激活ERK信号通路从而上调自噬水平。