【摘 要】
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二氢青蒿酸是合成抗疟疾药物青蒿素的最直接前体,其经过简单的氧化反应就可以合成青蒿素。通过微生物发酵合成二氢青蒿酸再经化学反应合成青蒿素的方法被认为是一条既经济可行的,又可应对市场需求变化的技术路线。本研究主要围绕在酿酒酵母中高效合成二氢青蒿酸进行。通过系统性地过表达酵母内源甲羟戊酸路径上的基因以及外源二氢青蒿酸合成相关基因,成功构建可高产二氢青蒿酸的酿酒酵母,摇瓶产量达到327.25 mg/L。然
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二氢青蒿酸是合成抗疟疾药物青蒿素的最直接前体,其经过简单的氧化反应就可以合成青蒿素。通过微生物发酵合成二氢青蒿酸再经化学反应合成青蒿素的方法被认为是一条既经济可行的,又可应对市场需求变化的技术路线。本研究主要围绕在酿酒酵母中高效合成二氢青蒿酸进行。通过系统性地过表达酵母内源甲羟戊酸路径上的基因以及外源二氢青蒿酸合成相关基因,成功构建可高产二氢青蒿酸的酿酒酵母,摇瓶产量达到327.25 mg/L。然后,本研究尝试通过优化关键基因CYP71AV1、DBR2以及转录因子GAL4的表达水平提高二氢青蒿酸的合成通量,并在此过程中找到了限制二氢青蒿酸产量进一步提高的因素:一是副产物青蒿酸的积累分走了约30%的代谢流,二氢青蒿酸合成偏好性有待提高;二是用多拷贝质粒表达的关键基因ADS、CYP71AV1和DBR2的表达效果不够稳定高效,进而影响二氢青蒿酸产量。为了提高二氢青蒿酸合成偏好性,本研究首先通过蛋白融合等手段,优化从青蒿醇到二氢青蒿酸的底物通道,使反应向有利于二氢青蒿酸合成的进行,并限制青蒿酸的合成,成功将二氢青蒿酸/青蒿酸的比值从2.53提高到6.97;然后,对选择性较差的醛脱氢酶AaALDH1进行了改造,通过蛋白结构分析找到了更利于合成二氢青蒿酸的H194R突变体,再综合对底物通道上的优化,将二氢青蒿酸/青蒿酸的比例进一步提高到了 10.02,并且没有牺牲二氢青蒿酸的产量。该比值为现有报道的异源合成二氢青蒿酸的最高值。为了使多拷贝质粒上的基因表达更加稳定高效,本研究开发了全新的pE2μ多拷贝质粒,代替传统多拷贝2μ质粒,提高了目标基因的拷贝数和表达量;利用pE2μ多拷贝质粒可将二氢青蒿酸产量提高到574.62 mg/L;利用自筛选标记TPI1和2μ质粒元件的过表达可进一步优化pE2μ质粒的稳定性并提高质粒拷贝数,二氢青蒿酸的产量也因此进一步提高到917.86 mg/L,是目前报道二氢青蒿酸异源合成的在摇瓶水平的最高产量。本研究通过二氢青蒿酸酿酒酵母的构建和优化为其他倍半萜产物的合成提供了基础,也为其他目标基因的多拷贝表达提供了新的思路和方法。
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