背景 视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)选择性凋亡是青光眼视神经萎缩和视野缺损的病理基础。P13K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶／丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,phosphatidylinositol 3-kinase pathway/protein kinase B,PI3K/Akt)信号转导通路是促进神经细胞存活的重要通路,但至今未见中医药对RGCs凋亡过程中PI3K/AKT信号通路有何影响的报道。目的 将补肾活血法应用于青光眼RGCs保护研究,以RGCs为核心研究补肾活血含药血清干预体外加压培养的Sprague-Dawley(SD)乳大鼠RGCs凋亡模型,通过对PI3K/Akt信号转导通路主要成员及相关底物中与凋亡有关的因子的表达及酶活性进行分析,阐明PI3K/Akt信号通路在RGCs凋亡过程中的作用机制及补肾活血法干预的影响,探索补肾活血法保护RGCs的机制。方法1.建立SD乳鼠RGCs混合培养及纯化培养模型。2.采取开放式压力控制培养系统建立体外加压培养RGCs模型。采取流式细胞仪检测细胞凋亡率。3.制备补肾活血含药血清,建立测定大鼠血清中丹参酮ⅡIA、三七皂苷R1、丹皮酚及泽泻醇A浓度的UPLC-ESI-MS/MS方法,选择外标法测定血清中丹参酮ⅡA的含量,内标法测定血清中三七皂苷R1、丹皮酚、泽泻醇A的含量,并对方法进行了全面验证,包括专属性、线性及线性范围、最低定量限、准确度与精密度、基质效应、稳定性、萃取/提取回收率,方法学验证结果完全满足生物样品分析测定要求后测试补肾活血含药血清中丹参酮ⅡIA、三七皂苷R1、丹皮酚、泽泻醇A的含量。4.将体外培养RGCs随机分为正常培养组(体外纯化RGCs不做处理)、对照组(80mmHg日压24h后20%正常SD大鼠血清培养)、5%补肾活血中药血清干预组(80mmHg加压24h后5%SD大鼠补肾活血中药含药血清培养)、10%补肾活血中药血清干预组(80mmHg加压24h后10%SD大鼠补肾活血中药含药血清培养)、20%补肾活血中药血清干预组(80mmHg加压24h后20%SD大鼠补肾活血中药含药血清培养)。采用CCK-8检测各组细胞活性,Annexin V-FITC/PI双染检测各组细胞凋亡率,Q-PCR、Western blot蛋白印迹法检测各组PI3K、Akt及一系列通路反应底物BAD、CREB、caspase-3 的 mRNA及蛋白表达水平。结果1.混合培养的RGCs可生长4w,纯化培养的RGCs可生长7d,纯度为96.97%。2.体外加压培养RGCs压力在20mmHgl 2h以上均可对RGCs造成损伤,40mmHg、 60mmHg.80mmHg时损伤明显,80mmH g加压24h细胞凋亡率最高,约为64.57±3.87%。3.测得大鼠补肾活血中药血清中主要有效成分丹参酮Ⅱ浓度范围为06～1.7ng、ml、三七皂苷R1浓度范围为335.3～2226.5pg/ml、丹皮酚浓度范围为1 1.8～19.1ng～ml、泽泻醇A浓度范围为4.1-10.8ng/ml、4.CCK-8检测各组细胞存活结果表明,RGCs经80mmHg加压培养24h后的无含药血清的对照组细胞OD值较正常培养组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而补肾活血含药血清干预组在5%、10%、20%浓度时细胞OD值均高于无含药血清的加压对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.AnnexinV/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡率结果显示RGCs经80mmHg(?)压培养24h后无含药血清的对照组细胞凋亡率较正常培养组明显增加(P<0.05),而补肾活血含药血清干预组在5%、10%、20%浓度时细胞凋亡率均低于无含药血清的对照组(P<0.05)。20%补肾活血含药血清干预组与5%、10%补肾活血含药血清干预组相比细胞凋亡率有所减低(P<0.05),差异有统计学意义。6.Q-PCR检测各组：nRNA结果：经80mmHg加压培养24h后的无含药血清对照组与正常培养组相比,细胞P13K.Akt.CREB的mRNA表达水平下降,差异统计学意义(P<0.05),而5%、10%、20%补肾活血含药血清干预组与对照组相比,PI3K、Akt.CREB mRNA含量逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。各组BAD的mRNA结果显示对照组与正常培养组相比,细胞BAD的mRNA表达水平未见明显增加(P>0.05),而5%、10%、20%补肾活血含药血清干预组与对照组相比,BAD mRNA有所降低,但不具有统计学意义(P>0.05)。各组caspase-3的mRNA结果无含药血清对照组与正常培养组相比,细胞caspase-3的mRNA表达水平明显升高(P<0.05)而5%、10%、20%补肾活血含药血清干预组与对照组相比,caspase-3 mRNA逐渐降低,且具有统计学意义(P>0.05)。7.Westernblot检测各组蛋白表达结果,经8OmmHg加压培养24h后的无含药血清对照组与正常培养组相比,细胞PI3K、Akt的蛋白表达水平下降,差异统计学意义(P<0.05),而5%、10%、20%补肾活血含药血清干预组与对照组相比,PI3K、Akt蛋白表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。各组BAD的蛋白表达无含药血清对照组与正常培养组相比,细胞BAD的蛋白表达水平明显升高(P<0.05),而5%、10%、20%补肾活血含药血清干预组与对照组相比,BAD蛋白表达逐渐降低,有统计学意义(P<0.05)。各组CREB的蛋白表达无含药血清对照组与正常培养组相比,细胞CREB的蛋白表达水平降低(P>0.05),而5%、10%、20%补肾活血含药血清干预组与对照组相比,CREB蛋白表达逐渐升高,10%、20%补肾活血含药血清与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。各组caspas-3的蛋白表达无含药血清对照组与正常培养组相比,细胞caspase-3的蛋白表达水平明显升高(P<0.05),而5%、10%、20%补肾活血含药血清干预组与对照组相比,caspase-3蛋白表达逐渐降低,且10%、20%补肾活血含药血清与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。结论1.体外混合培养的RGCs存活时间较长,纯化培养的RGCs可存活7d左右。2.体外加压培养RGCs压力在20mmHg12h以上均可对RGCs造成损伤,80mmHg加压24h细胞凋亡率最高。3.首次建立并验证大鼠补肾活血中药血清中主要有效成分丹参酮ⅡA、三七皂苷R1、丹皮酚、泽泻醇含量测定的UPLC-MS/MS方法,并首次采用UPLC-MS/MS法测得大鼠补肾活血中药血清中主要有效成分的浓度范围。4.补肾活血含药血清可以抑制体外加压培养大鼠视网膜神经节细胞的凋亡,其中20%浓度补肾活血中药血清对体外加压培养RGCs的凋亡抑制最为明显。5.补肾活血含药血清可上调体外加压培养RGCs细胞P13K及Akt的RNA及蛋白表达,其中20%浓度补肾活血含药血清组对体外加压培养RGCs的PI3K及Akt的 mRN吸蛋白表达上调最为明显。这表明补肾活血法可能激活了PI3K/Akt信号转导通路。6.补肾活血含药血清可下调体外加压培养RGCs细胞促凋亡因子BAD的蛋白表达,上调CREB的mRN表达,其中20%浓度补肾活血含药血清组对体外加压培养RGCs的BAD的蛋白表达下调及CREB的mRNA表达上调最为明显。这表明补肾活血法可能抑制促凋亡因子BAD的表达,上调生存基因CREB的表达。7.补肾活血含药血清可下调体外加压培养RGCs细胞c spase-3的mRNA及蛋白表达,其中20%浓度补肾活血含药血清组对体外加压培养RGCs的caspase-3的mRNA及蛋白表达下调最为明显。这表明补肾活血法可能抑制了RGCs凋亡过程中caspase-3的活化。