论文部分内容阅读
Claudins是近年发现的一个多基因家族，至今已发现超过24个家族成员，Claudins蛋白被认为是形成紧密连接的骨架。在不同的组织和不同的病理生理状态下，Claudins家族成员的表达与分布有明显变化，屏障功能相应改变，而已有的关于他们的研究主要集中在上皮组织中。新生血管生长是糖尿病视网膜病变等眼部血管性疾病的主要病理特征和严重并发症，原有的血-视网膜内屏障的紧密连接的破坏和/或视网膜新生血管内皮细胞间的紧密连接屏障发育不完善引起渗漏、出血、和/或水肿等，进而导致患者严重视力损害。迄今为止，关于Claudins在视网膜组织及病理性视网膜新生血管上的研究甚少。因此，本研究首先研究了正常小鼠视网膜中Claudins的mRNA和蛋白表达与分布，然后以氧诱导视网膜病变模型为主要方法，检测了视网膜新生血管生成时Claudins表达的时空变化。
第一部分正常小鼠视网膜组织中紧密连接蛋白Claudins的表达与分布研究
目的：探讨正常小鼠视网膜组织中紧密连接蛋白Claudins的表达与分布特点。
方法：取出生后第18天(P18)正常小鼠视网膜和6周龄成年小鼠视网膜、肾脏和脑组织提取RNA，用RT-PCR检测紧密连接蛋白Claudins的mRNA表达水平。提取P8、11、13、15、18和21天小鼠视网膜组织RNA，实时荧光定量RT-PCR检测视网膜发育过程中Claudins mRNA表达的动态变化。P18小鼠眼球冰冻切片免疫荧光染色检测紧密连接蛋白Claudin-1～-5，-7，-12和-23在视网膜的分布，P18小鼠免疫荧光视网膜全层铺片检测Claudin-1、-2和-5在视网膜深、浅层血管的表达与分布。
结果：在正常P18天和6周龄成年小鼠视网膜组织中均能检测到多种Claudins基因mRNA水平的表达。其中表达最高的是Claudin-5、-12和-23，其次是Claudin-1～-４、-7、-9、-10、-11、-19、-20和-22，与P18小鼠相比，6周龄成年小鼠中Claudin-1、-2、-4、-9和-19表达降低，而Claudin-18表达增高。作为阳性对照标本的6周龄小鼠肾脏和脑组织中检测到多种Claudins的表达，但四种组织中均未检测到Claudin-6的表达。在正常小鼠视网膜发育过程中，mRNA表达变化超过2倍的有Claudin-1～-5、-7、-12，-14～-17，-22和-23。P18小鼠冰冻切片免疫荧光染色显示Claudin-1、-2、-4和-5均分布在神经节细胞层(GCL)、内丛状层(IPL)和外丛状层(OPL)，Claudin-4的分布与IsolectinB4没有共定位，而Claudin-1、-2和-5均与IsolectinB4呈共定位分布。Claudin-3和-23仅在神经节细胞层中检测到表达，Claudin-12仅分布在外丛状层，Claudin-3、-12和-23均不与IsolectinB4呈共定位分布。视网膜冰冻切片免疫荧光未检测到Claudin-7的表达。视网膜铺片免疫荧光染色显示P18小鼠视网膜深层浅层血管网上均有Claudin-1、-2和-5的表达，呈线性均匀分布。
结论：从P8至P21，伴随视网膜的发育，Claudin-1、-2、-3、-4、-5、-12和-23的mRNA呈先增高后降低的动态表达趋势，其中Claudin-1、-2和-5分布在视网膜深浅两层各级血管上，对于血-视网膜内屏障功能具有重要作用，而不分布在血管上的Claudin-3、-4、-12和-23则可能对视网膜神经发育具有重要作用。
第二部分Claudins在氧诱导的小鼠血管增殖性视网膜病变中的差异表达
目的：探讨OIR小鼠视网膜新生血管形成时血-视网膜内屏障的功能状态以及Claudins表达和分布的特点。
方法：用C57BL/6J乳鼠建立氧诱导视网膜病变(OIR)模型，于出生后7天将乳鼠随同母鼠放入含氧体积分数为75％的养箱中饲养5天，P12放回到正常大气环境中继续饲养5天。于P18行FITC-Dextran心脏灌注及伊文思蓝腹腔注射视网膜铺片分别检测OIR成模情况和OIR小鼠视网膜内屏障功能。P18行腹腔注射伊文思蓝测定视网膜组织中染料含量，定量检测视网膜内屏障功能。P8、P11、P13、P15、P18和P21提取视网膜组织RNA和蛋白，分别行实时荧光定量PCR和Western blot检测Claudins的mRNA和蛋白表达的动态变化，P18行视网膜铺片免疫荧光染色激光共聚焦扫描显微镜检测Claudin-1、-2和-5的空间分布特点。
结果：FITC-Dextran灌注视网膜铺片显示P18天时，OIR小鼠视网膜出现大量新生血管生成伴视乳头周围无灌注区形成，伊文思蓝腹腔注射视网膜铺片显示P18天OIR小鼠视网膜中大片染料渗漏，定量检测OIR小鼠视网膜中染料含量为(20.47±6.73)μg×μl×h×μg-1，而正常小鼠视网膜中染料含量为(1.75±1.08)μg×μl×h×μg-1，其差别具有统计学意义。实时荧光定量PCR检测到Claudin-1～-4、-7、-12和-23在OIR和正常小鼠视网膜中的表达存在差异；Western blot显示在正常和OIR小鼠视网膜中，Claudin-2和-5的蛋白表达水平均呈先增高后降低的趋势，Claudin-2和-5在P18达到高峰，与正常小鼠相比较，OIR小鼠视网膜中Claudin-1的表达在P8至P21各个时间点的差别均无统计学意义，Claudin-2和-5在P15、P18和P21均表现升高，其差别具有统计学意义。视网膜铺片激光共聚焦显微镜扫描显示正常P18小鼠视网膜血管网上这三种紧密连接蛋白的分布具有一致性，它们均匀分布在各级血管上，呈线性红色荧光围绕血管内皮细胞边缘，呈梭形排列，在胞浆内即网眼中偶尔可伴少量点状染色，而在OIR小鼠视网膜中，血管内皮细胞间的紧密连接出现排列紊乱，但荧光强度反而升高，内皮细胞边界的线性荧光连续性中断，新生血管团中荧光在细胞内的分布特点更为明显，网眼中的点、团状分布的荧光强度更强。
结论：Claudin-1、-2和-5在氧诱导的小鼠血管增殖性视网膜病变中新生血管内皮细胞上差异表达和细胞浆的再分布，是病现性视网膜新生血管屏障破坏的分子机制。调控Claudin-1、-2和-5的表达与分布对重塑视网膜新生血管有着重要意义，将为治疗病理性视网膜新生血管性疾病提供新思路、新策略。