论文部分内容阅读
目的：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因为具备高度增殖能力,多向分化潜能,低免疫源性,不涉及伦理道德成为骨组织工程研究中的重要种子细胞,本文选择骨髓源性MSCs,通过动物实验探讨补肾活血法联合骨髓间充质干细胞移植对骨折愈合的影响及可能机制；在中医骨折治疗理论“血不活则瘀不能去,瘀不去则骨不能接”及“肾主骨、肾生骨髓”的指导下,分析补肾活血法治疗骨折的合理性和可行性,通过临床观察补肾活血法治疗桡骨远端骨折的临床疗效,为中医药临床应用治疗骨折立法选择提供理论依据。方法：一、实验研究方面(一)细胞的培养、鉴定及PKH26标记通过骨髓贴壁法及皮质骨胶原酶消化法进行大鼠MSCs培养、鉴定,流式细胞仪测细胞周期,采用细胞免疫荧光法鉴定G2代MSCs表面抗原标志CD3、CD44、CD105,成骨及成脂诱导证实其多向分化潜能,并用PKH26荧光染料标记BMSCs。(二)补肾活血汤联合骨髓间充质干细胞静脉移植对大鼠骨折愈合影响的实验研究将骨折大鼠分随机分为未造模+BMSCs移植的空白组(A)；骨折造模+BMSCs移植组(B)；补肾活血汤(简称BS)高剂量+BMSCs移植组(C)；BS中剂量+BMSCs移植组(D)；BS低剂量+BMSCs移植组(E)。造模7天后通过小动物活体荧光成像系统分析其外源性BMSCs向骨折断端迁移情况；通过眼底静脉采血检测3、7、14天血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)及钙含量；通过蛋白印迹法检测3、7、14天骨折断端Runt相关转录因2(Runt-related transcription factor2, Runx2)蛋白的表达。二、补肾活血方治疗肱骨近端骨折的临床研究简单随机选取广州中医药大学附属骨伤科医院住院部桡骨远端骨折患者59例,分为治疗组与对照组,治疗组予以口服补肾活血汤29,对照组30例,余常规治疗相同。观察骨代谢指标血清钙及碱性磷酸酶,临床疗效(包括疼痛视觉模拟评分法评分及腕关节功能Gartland&Werley评分)改善情况。结果：一、实验研究(一)大鼠MSCs的分离、培养、鉴定及PKH26标记结果表明,皮质骨胶原酶消化法及骨髓贴壁法均能有效分离纯化大鼠MSCs,经形态学,细胞表面抗原免疫荧光鉴定,成骨及成脂诱导分化证实为间充质干细胞。并完成骨髓间充质干细胞的PKH26标记,阳性率达到97%。(二)补肾活血汤联合BMSCs静脉移植对大鼠骨折愈合影响的实验研究骨折造模后7天,小动物活体荧光成像分析PKH26标记的BMSCs向骨折断端迁移,骨折未造模的空白组未见荧光,骨折断端平均荧光强度高、中、低剂量BS联合BMSCs移植组与模型组(单纯BMSCs注射+骨折造模)及空白组比较有统计学意义：3天时,各组血清钙离子及碱性磷酸酶含量与模型组比较无统计学意义,7天时中剂量BS联合BMSCs移植组与模型组血清钙含量比较有统计学意义(P<0.05),血清碱性磷酸酶含量高、中、低剂量BS组与模型组比较没有统计学意义；14天时,血清钙含量高、中、低剂量BS组与模型组比较有统计学意义,血清碱性磷酸酶高、中剂量BS组与模型组比较有统计学意义(P<0.05)；3、7、14天骨折断端Runx2蛋白表达高、中、低剂量BS组与模型组及空白组有统计学意义(P<0.05),且模型组表达高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。二、补肾活血汤治疗桡骨远端骨折的临床观察补肾活血汤对桡骨远端骨折骨代谢生化指标影响结果,治疗前两组血清ALP含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)；术后14天,治疗组与对照组在治疗后血清ALP都升高,差值有显著性差异(P<0.05),治疗组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗前两组血清钙含量比较,差异无统计学意义(P>0.05),术后14天,治疗组及对照组血清钙含量与治疗前比较差值无显著性差异(P>0.05),治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。患者1月后VAS评分,两组治疗前比较,差异无统计学意义(P>0.05),两组治疗后均较本组治疗前差值有显著性差异(p<0.05),治疗后治疗组与对照组比较差异有统计学意义(p<O.05),治疗组优于对照组。2月后腕关节功能Gartland&Werley评分(分为4个等级,优：0-2分；良3-8分；可：9-20分；差≥21分),两组经治疗后,治疗组优良率为93.1%,对照组优良率为73.3%,经x2检验(p<0.05),两组疗效差异有显著性,治疗组疗效优于对照组。结论：一、骨髓贴壁法与皮质骨胶原酶消化法均能实现间充质干细胞的提取、纯化、及扩增,并完成了骨髓间充质干细胞的PKH26标记,标记阳性率大于97%,为下一步的实验提供了种子细胞。二、进一步证实了外源性BMSCs能够向骨折断端归巢,补肾活血汤能够促进外源性BMSCs向骨折断端迁移；补肾活血汤联合BMSCs静脉移植能够促进骨折愈合,其作用机制需要进一步研究。三、补肾活血汤能够上调桡骨远端骨折患者术后血清ALP含量及改善疼痛症状、改善临床疗效、且无明显不良反应。