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pUC-UOX质粒经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切得到大鼠UOX cDNA完整序列,将该基因亚克隆到pTRE表达载体的tet应答片段（tetracycline response element,TRE）和缺少增强子的微小CMV早期启动子下游的多克隆位点,构建成应答质粒载体pTRE-rUOX。采用ClonfectinTM Transfection Reagent将pTRE-rUOX和筛选质粒pTK-Hyg共转染入CHO-AA8细胞中,用200μg/ml匀霉素筛选2周,选出50个稳定表达外源基因的细胞克隆,最后挑选出5个高表达低背景的细胞克隆,成功的建立了体外培养的CHO细胞条件性表达大鼠UOX基因的模型,通过Southern blot和Western blot检测以及超微形态分析,观察四环素处理后不同时间UOX表达变化,并应用免疫胶体金标记法对UOX蛋白进行研究,现得出以下结果: 1.Southern印迹检测显示经pTRE-rUOX转染的CHO细胞中有转入的外源大鼠UOX基因,Western印迹检测显示在无Tc的细胞培养基中培养的细胞高水平表达大鼠UOX,添加Tc不同时间后UOX的表达水平逐渐下降,7天后未能检测到其表达;未转染的CHO细胞则没有检测到UOX基因和UOX蛋白。 该结果说明在加入Tc后,Tc作为调控剂通过竞争性的与tetR结合,阻碍了tTA与应答质粒的TRE的结合,使缺少增强子的微小CMV启动子表现为转录沉默,从而导致UOX基因的表达终止,而已表达的UOX基因则逐渐被核酸酶降解。同样,已翻译的大鼠UOX在宿主细胞内逐渐被宿主细胞内蛋白代谢系统降解。 2.免疫电镜检测显示高水平表达的大鼠UOX可特异性地被运输至过氧化物酶体中,并具备原有的形态学特点。超微形态观察发现在加入Tc后1～3天,细胞质内可见到高电子密度、由单层膜包绕的结构,同时也观察到在细胞质中有较多溶酶体出现,一些UOX被许多吞噬小体和溶酶体包绕,另有一些溶酶体内或其周围有UOX样结构。加入Tc第5天,已经观察不到完整的UOX结构,只在一部分细胞中观察到类似UOX的电子密度较高的结构,细胞质内溶酶体数量增加。Tc诱导7天后,溶酶体中或其周围未再观察到UOX样结构的存在。酸性磷酸酶染色显示包绕并吞噬分解外源蛋白的结构是呈染色阳性的溶酶体结构。免疫电镜观察发现Tc诱导7天后被包绕在溶酶体周围的结构未见胶体金颗粒的标记。 该结果说明重组大鼠尿酸氧化酶被特异性转运到过氧化物酶体中,不仅仅是大鼠