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槲寄生又名北寄生、柳寄生、寄生子,为桑寄生科(Lorantheceae)半寄生常绿小灌木。常寄生于桑科、茶科、山毛莫科、芸香料、蔷薇科和豆科等29科50余种植物上。该属植物有36个种,我国分布11个种,在我国大部分省区都有分布,主产于河北、辽宁、吉林、内蒙古等省区内。槲寄生作为传统中药有着悠久的历史,我国传统上将它作为祛风湿药物,其味苦、平,归肝、肾经,有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎作用,一般以干燥的带叶茎枝入药。在欧洲,含有槲寄生毒素、凝集素等糖蛋白的制剂长期以来被用作癌症治疗的辅助药物,如Iscador,Helixor和Plenoso等。近年来国内外对槲寄生的研究发展较快,不断发现新疗效和新应用,槲寄生抗肿瘤活性物质主要有槲寄生生物碱、槲寄生蛋白和槲寄生多糖等,其中的槲寄生蛋白以其种类多和抗肿瘤活性强而越来越受到广大研究者的关注。
本文对槲寄生糖蛋白的分离纯化进行了初步研究,期望能从槲寄生药材中得到具有抗肿瘤活性的蛋白。主要内容包括槲寄生浸提液的组成对槲寄生浸提率的影响实验,并对槲寄生蛋白的提取进行工艺优化;各种脱色介质对槲寄生蛋白粗品复溶液脱色的实验研究,并找出较好的脱色工艺路线;脱色后槲寄生蛋白溶液分离纯化条件的实验研究;分离纯化所得蛋白的理化性质的初步研究。
首先本文在确定了浸提液种类、浸提温度、盐析硫酸铵饱和度后,通过正交实验研究了浸提时间、料液体积比及浸提次数对槲寄生浸提率的影响。确定槲寄生蛋白的最优提取工艺为:浸提液为含0.1 mol/L乳糖的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.30),槲寄生浸提液盐析时硫酸铵饱和度为70%,浸提温度为4℃,浸提时间为36h,料液体积比为6,浸提2次。槲寄生蛋白收率为0.189%。
其后,对槲寄生蛋白粗品复溶液进行了脱色工艺研究。重点考察了D707树脂和颗粒活性炭柱层析的脱色工艺条件。以脱色率、蛋白损失率和经济效益为考察指标,确定颗粒活性炭的脱色工艺条件为最优,其脱色工艺条件为:槲寄生蛋白复溶液粗品脱色时的最佳pH值为4.50,活性炭最佳用量为10 g活性炭/50 mL槲寄生粗蛋白复溶液,样品吸附流速为0.6 mL/min,洗脱液为0.5 mol/L硫酸铵(pH8.50)。槲寄生蛋白粗品复溶液在脱色前不需透析,可直接上样进行脱色。
最后采用DEAE-纤维素离子交换树脂对脱色后槲寄生蛋白进行分离纯化研究。考察了上样流速、洗脱液、样品pH值等工艺条件。确定分离纯化工艺条件为:离子交换层析中平衡液和样品溶解均选用0.01 mol/L的Tris-HCl(pH7.50)缓冲液,洗脱液为1.0 mol/L NaCl(pH8.50)Tris-HCl缓冲液,洗脱流速与上样流速均为0.5 mL/min。分离得到两种蛋白HJS1和HJS2。HJS1和HJS2的产率分别为0.62‰和0.41‰。
本论文还对HJS1和HJS2作了简单的理化性质研究。实验表明HJS1和HJS2已达电泳纯,分子量分别约为60 kDa和130 kDa。按硫酸-苯酚法测得HJS1的分子中含有约1.59%的中性糖,HJS2的分子中含有约3.65%的中性糖。表明所提纯蛋白HJS1和HJS2为含糖量很低的一种糖蛋白。
本文分离纯化后得到两种槲寄生蛋白HJS1和HJS2,对新药开发的深入研究具有一定价值。