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Spred (Sprout-related Ena/vasodilator stimulated phosphoprote in homology-1(EVH-1) domain)蛋白家族与Sprouty相关,包括3个主要结构域：N端结构域(EVH-1区),中央c-kit结合区(KBD区)和C端的半胱氨酸富含区(SPR区)。EVH1区是特异结合富含脯氨酸的序列,将蛋白锚定到特定位点行使功能,例如：骨架重构；肌动蛋白调节；突触转导；增殖和分化等。KBD区是包含一段致癌受体酪氨酸激酶c-kit的结合序列,对生长因子(EGF、EPO)介导的ERK/MAPK的活性有抑制作用,但非必需。SPR区是非常保守的富含半胱氨酸sprouty相关序列,负向调节生长因子介导的Erk的活性。同时Spred对多种生长因子诱导的Ras-ERK途径有抑制作用。Spred蛋白家族负向调节Ras/ERK通路并影响细胞增殖和细胞分化,SPR区在该过程中起重要作用,然而其作用机制尚未阐明。本研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的p85亚基与Spred-2蛋白的SPR区相结合。此外,SPR区的第303位、343位、353位酪氨酸共同突变不仅能够剥夺表皮生长因子介导的Spred-2蛋白与p85亚基的结合,还会减弱Spred-2蛋白对Ras/ERK活化作用的抑制。因此与野生型相比,Spred-2蛋白突变体导致Hela细胞增殖加快、PC12细胞分化加强。进一步的研究表明,p85亚基与Spred-2蛋白的结合能够增强Ras蛋白与Spred-2蛋白结合,同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化,从而进一步加强Spred-2蛋白的抑制作用,影响Ras/ERK活化。取得的研究结果如下：1、293T细胞经脂质体转染pRK5-Myc-Spred-2质粒及其各段缺失体,经饥饿、刺激等处理后通过免疫共沉淀实验和Western blot检测发现p85亚基与Spred-2蛋白结合并且依赖于Spred-2蛋白的SPR区和p85亚基的SH2区。2、采用分子亚克隆技术及PCR法定点诱变分别构建了Spred-2蛋白SPR区第303位、343位、353位酪氨酸的单突变体,343位、353位酪氨酸的双突变体以及同时突变三个位点的三突变体,进行免疫共沉淀实验和Western blot检测到SPR区的第303位、343位、353位酪氨酸共同突变不仅能够剥夺表皮生长因子介导的Spred-2蛋白与p85亚基的结合,还会减弱Spred-2蛋白对Ras/ERK活化的抑制。3、将空载体、p85亚基及其缺失体分别与Spred-2蛋白和Ras蛋白共转染,发现p85亚基与Spred-2蛋白的结合能够增强Ras蛋白与Spred-2蛋白相互作用,同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化,从而进一步加强Spred-2蛋白的抑制作用。4、通过构建空载体、Spred-2蛋白及其突变体、缺失体的重组腺病毒分别感染Hela和PC12细胞、采用台盼蓝计数法和神经突触伸长分析发现与野生型相比,Spred-2蛋白p85亚基结合位点的突变体导致Hela细胞增殖加快、PC12细胞分化加强。综上所述,本研究发现经EGF刺激后,p85亚基被招募至Spred-2蛋白,且Spred-2蛋白的Tyr303、343及353位点对于EGF诱导的p85亚基与Spred-2蛋白的结合及Spred-2蛋白对Erk1/2活化的抑制均是必需的。p85亚基与Spred-2蛋白能够增强Ras蛋白与Spred-2蛋白结合,同时还能降低Spred-2蛋白本身的泛素化,从而进一步加强Spred-2蛋白的抑制作用,这是有关Spred-2蛋白与p85亚基相互作用参与调节EGF介导的Erk1/2活化的首次研究。